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人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建
目的 构建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体文库.方法 采用Trizol试剂提取尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞的总RNA,用Oligotex@mRNA Mini Kits纯化获得总mRNA,逆转录合成总cDNA,针对人抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物,以合成的总cDNA为模板,扩增得到抗体轻链和重链可变区基因库,再通过重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)将轻链和重链拼接得到scFv文库;将scFv基因双酶切后,插入T7噬菌体骨架进行包装,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原进行4轮淘选,建立蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,采用噬斑法检测scFv噬菌体文库滴度并进行PCR及测序鉴定.结果 成功地将轻链和重链可变区基因库混合拼接得到scFv文库;经4轮淘选,蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库滴度为6.0×1014PFU/ml,抗体基因在噬菌体中表达的阳性率达50%以上,表达的scFv片段均为轻链和重链的杂合体,可较好的重现可变区的多样性.结论 已成功构建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,为下一步噬菌体文库的克隆构建和筛选奠定了基础.
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抗体文库展示技术在抗体新药开发中的应用
1975年,Kohler和Milstein将分泌抗体的B细胞和骨髓瘤细胞融合,用杂交瘤细胞培养生产单克隆抗体[1].随后,1986年,美国食品药物管理局(FDA)批准了第一个用于治疗的单克隆抗体[2],一种定位于人类的CD3的鼠源抗体.由于鼠源抗体具有免疫原性,导致在人体内迅速地被清除,从而表现为低效率治疗效果,高风险的输液反应,因此,除2002年的定位于CD20,治疗Non-Hodgkin lymphoma的Zevalin以外[3],FDA没有再批准任何的鼠源抗体.1994年,第二个治疗性抗体由FDA批准上市,ReoPro[4],anti-GpⅡb/gpⅡa,治疗心血管疾病,抗体的类型为嵌合型抗体,标志着抗体的发展有了明显的倾向-人源化.
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利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展
1985年,美国Missouri大学的Smith GP将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage, fd)的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术(1).
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噬菌体表面呈现技术及其在原虫免疫学研究中的应用
1 概述 噬菌体表面呈现技术(Phage Display Technique,PDT)是以噬菌体为载体将外源蛋白或小分子多肽与噬菌体衣壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面,表达的外源蛋白和多肽保持相对独立的空间结构和生物活性并且这种表达不影响噬菌体的侵染能力,因此可以被其相应的结合分子识别筛选.该技术将基因表达产物展示于噬菌体表面,在蛋白基因型和表型之间建立了联系,被广泛应用于抗原表位的分析、抗体文库的构建和筛选、多肽药物的研制、细胞间信号的转导、分子间的识别等领域,为研究疫苗和研制诊断试剂提供了崭新的模式.
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噬菌体表面呈现技术及其在肾脏病中的应用
噬菌体表面呈现(phage display)技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面。这种外源蛋白或多肽可以识别相应的结合分子而被筛选鉴定出来。本文综述了噬菌体表面显现技术的建立,抗体文库、肽文库构建及在肾脏病研究领域的应用与前景。
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抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体文库的筛选及可溶性抗体的制备
目的 制备高活性的可溶性抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体。方法采用ELISA等方法从文库中筛选高活性的抗体,再通过转染大肠杆菌HB 2151使其以可溶性抗体形式表达。结果获得了可溶性抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体。结论建立了一种制备抗人血管生长素抗体的方法,该抗体在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。
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噬菌体展示抗体文库的研究进展
噬菌体展示技术(Phage display techniques)兴于20世纪90年代初.该技术能将目的的基因表达的多肽或蛋白质展示在噬菌体表面,并保持目的蛋白(或多肽)相对独立的空间结构和生物学活性.