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腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证
目的 建立腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法,并进行验证.方法 针对腮腺炎减毒活疫苗株S79血凝素(hemagglutinin,H)基因保守区域设计特异性引物和TaqMan荧光探针;以05008批腮腺炎减毒活疫苗S79株成品作为参考品,将参考品或供试品稀释后,接种于长成单层的Vero细胞中,采用低渗合并冻融法将细胞破碎,吸取上清,进行荧光定量RT-PCR.优化病毒感染时间,并对该方法的特异性、精密性及准确性进行验证.结果 病毒感染的佳时间为18h;建立的荧光定量RT-PCR法只对腮腺炎减毒活疫苗具有特异性扩增,对灭活的腮腺炎减毒活疫苗、水痘病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、风疹病毒和Vero细胞均无扩增曲线出现;该方法检测4个浓度(1、1∶5、1∶52、1∶53)样品6组数据的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜5％,不同操作人员于不同日期检测4个浓度(1、1∶5、1∶52、1∶53)样品的标准曲线回归方程R2均大于0.97,RSD均＜5％;该方法与细胞病变法测得的11批腮腺炎减毒活疫苗成品的病毒滴度值之差均≤0.2 LgCCID50/ml,两组数据差异无统计学意义(P＞0.05).结论 建立的荧光定量PCR法检测腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度特异性较强,精密性和准确性良好,且快速方便,可应用于企业生产过程中的内部质控.
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柯萨奇病毒A组16型感染性滴度检测用国家参考品的制备及标定
目的 制备柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)感染性滴度检测用国家参考品,为CA16疫苗生产过程中的病毒滴度控制和CA16疫苗的免疫效果评价提供国家参考品.方法 将验证合格的CA16(C1亚型)培养液分装(0.5 ml/支)制成候选参考品.3个独立实验室分别对候选参考品进行协作标定,用细胞培养法检测CA16感染性滴度,用Behrens-K(a)rber法计算半数细胞感染量(50％ cell culture infective does,CCID50).同时,将CA16参考品分别置于-20、4、22～25(室温)和37℃条件下或反复冻融,进行热稳定性、长期稳定性和冻存稳定性研究.结果 制备的CA16参考品的病毒滴度为(6.80±0.95) lgCCID50/ml.CA16参考品于-60℃保存12个月、-20℃保存6个月和4℃保存28 d后的病毒滴度无显著下降,表明稳定性较好;在22～25℃(室温)和37℃条件下,CA16参考品每天的病毒滴度损失率分别为3.4％和4.4％,而且分别保存27和21 d后病毒滴度无明显下降;对CA16参考品反复冻融的病毒滴度损失率为4.8％/次.结论 成功制备了CA16感染性滴度检测用候选国家参考品,将CA16参考品赋值确定为(6.80±0.95) lgCCID50/ml.
