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基于半导体测序的人乳头瘤病毒核酸分型检测技术性能评估
目的:评价基于半导体测序法的人乳头瘤病毒(HPV)核酸分型检测技术性能,探讨其临床应用价值.方法:采用半导体测序技术检测30种HPVL1基因分型国家参考品、9种HPV全基因组分型国家参考品及500例已知HPV分型检测结果的临床宫颈脱落细胞DNA样本,评价该技术的分析性能及与临床检测等效性.结果:半导体测序法可准确分型检测16种HPV型别(HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68),检测范围内的16种HPV型别之间无交叉反应,与其他HPV型别及人类基因组DNA亦无交叉反应,低检测限为10拷贝/μl(即50拷贝/反应),与已知结果的总体阳性符合率为99.33％ (298/300),阴性符合率为100％ (200/200),总符合率为99.60％ (498/500),一致性系数(Kappa)值为0.99,两种检测方法具有较高的一致性.结论:基于半导体测序法的HPV核酸分型检测技术具有分型准确,特异性高,灵敏度高,检测通量高等优点,具有较高的临床应用价值.
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腮腺炎减毒活疫苗国家参考品的制备及标定
目的:制备腮腺炎减毒活疫苗国家参考品,并进行标定.方法:选用国内腮腺炎疫苗生产毒株S79制备腮腺炎疫苗参考品.在生产过程中严格控制精密性、水分含量,对候选参考品进行鉴别试验、病毒滴度、水分含量、牛血清蛋白残留量及无菌检查等试验.检验合格后组织4个实验室对候选参考品病毒滴度进行协作标定,计算实验室内变异及实验室间变异系数;对候选国家参考品进行稳定分析.结果:制备的候选参考品鉴别试验、无菌检查结果均符合规定,水分含量为1.6％.经协作标定,腮腺炎减毒活疫苗病毒滴定候选国家参考品的病毒滴度为(4.96±0.38) lgCCID50·mL-1,实验室内变异系数在2.0％ ～4.1％之间;稳定性考核数据显示制备的参考品具有较好的稳定性.结论:制备的参考品符合作为腮腺炎减毒活疫苗国家参考品的要求.
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甲基安非他明检测试剂盒国家参考品的研制
目的 研究并建立甲基安非他明检测试剂盒国家参考品.方法 通过检测阈值确定、原料筛选、参考品组成的确定、参考品配制等步骤制备甲基安非他明检测试剂盒国家参考品,并采用经方法学验证的液质联用含量测定法对样品盘进行标定及稳定性考察.结果 建立的甲基安非他明检测试剂盒国家参考品包括阳性参考品1份,阴性参考品12份,低检测限参考品3份,重复性参考品1份.结论 建立甲基安非他明检测试剂盒国家参考品,该参考品的准确性和稳定性均可以满足作为参考品的要求.该参考品通过了5家检测试剂盒生产企业的协作标定.为甲基安非他明检测试剂盒的质量控制建立统一的标准物质,有助于规范我国毒品类试剂盒的研制和生产过程的规范.
关键词： 甲基安非他明检测试剂盒 国家参考品 液质联用 -
首批人血白蛋白国家参考品的研制
目的 制备首批人血白蛋白国家参考品,用于人血白蛋白产品放行、批签发或注册检验等质量控制工作.方法 选择经检验合格的人血白蛋白产品作为原料进行合并、除菌、分装.制备后按照2015年版《中国药典》三部人血白蛋白各论初步选定7个检验项目,包括:蛋白质含量(凯式定氮)、辛酸镝含量测定、多聚体含量、pH测定、吸光度测定、钠离子含量、铝离子含量,在11家实验室进行协作标定,同时进行稳定性监测.结果 依据11家实验室协作标定结果确立该批国家参考品的参考值范围分别为:蛋白质含量(193.30±5.08)g·L-1;辛酸钠含量(0.162 4±0.009 2) mmol·g(Pro)-1;多聚体含量(2.72±0.29)％(HPLC-SEC);pH值(6.71±0.08)[测定温度(22±3)℃];吸光度(0.030±0.005);钠离子含量(134.9±23.6) mmol ·L-1;铝离子含量协作标定范围为(88.4±30.5) μg·L-1,但铝离子含量项目在稳定性监测过程中出现明显上升趋势,因此该项目不纳入参考品终发布的标定项目.结论 该批人血白蛋白参考品符合相关要求,可以作为国家参考品发放.有利于人血白蛋白产品的质量控制.
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首批抗甘露聚糖肽血清国家参考品的研制
目的 建立首批抗甘露聚糖肽血清国家参考品.方法 制备冻干抗甘露聚糖肽血清候选国家参考品,组织3家实验室采用补体结合法协作标定其效价,并对其进行稳定性考察.结果 抗甘露聚糖肽血清候选国家参考品的效价为1:16,且具有较好的稳定性.结论 该候选国家参考品符合国家参考品的各项要求,并已被国家有关部门批准正式使用.
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抗HCV国家参考品及高质量丙肝诊断试剂的研究
丙型肝炎病毒(HCV)于1989年刚刚被发现,它的基因为一条正链RNA分子,在我国人群中的感染率为3.2%.丙型肝炎通过血液传播,慢性化率很高,目前尚无预防疫苗,也无特效治疗药物.阻断其传播的有效途径为用丙肝试剂筛查供血员和血液制品,为诊断丙型肝炎则需要进行基因检测和对初筛结果进行确证.
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第二代基因测序诊断产品批准上市
2014年6月30日，国家食品药品监督管理总局经审查，批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定连接测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。该批产品可通过对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序，对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行无创产前检查和辅助诊断。国家食品药品监督管理总局高度关注基因测序诊断产业发展，鼓励创新、加强服务，在相关产品注册工作中精心组织、加强协作、严格审评，在确保产品安全、有效前提下，保证了工作的进度。同时，还组织相关技术部门研制完成基因测序诊断产品相关国家参考品，填补了国际空白。
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甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品的研制
目的 研制甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品.方法 收集甲型H1N1流感病毒及其他病毒培养物,用实时荧光PeR方法 逐一进行验证.参考品通过协同标定,确定低检出限范围,7家单位进行适用性检测.反复冻融观察其稳定性.结果 所用的3株病毒经实时荧光PCR验证,特异性良好,经基因芯片进一步验证,均为甲型H1N1流感病毒,且无其他病毒核酸污染,经7家单位检测,符合国家参考品标准要求;反复冻融3次后,稳定性良好.结论 建立了第1套甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品及相应的质量标准,并已被国家有关部门批准正式使用.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 核酸 国家参考品 -
戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品的建立
目的 制备戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品.方法 从我国多省血液中心、采浆站收集血清、血浆样品300份,应用国内外5家HEV IgG抗体诊断试剂进行筛选,制备HEV IgG国家参考品,并对参考品的稳定性及适用性进行检测.结果 制备了HEV IgG国家参考品,其中阴性参考品30份;阳性参考品10份;灵敏度参考品1份,依据HEV IgG国际标准品进行标化,定量为3 U/ml;精密性参考品l份.参考品经4 ℃及室温放置10d,37℃放置7d,以及反复冻融3次后,测定结果与-20℃放置参考品检测结果一致,稳定性良好.5个厂家试剂对参考品的检测结果显示该参考品具有较好的适用性.结论 制备了戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品,为提高诊断试剂的质量奠定了基础.
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结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品的研制
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
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水痘带状疱疹病毒IgG抗体检测试剂国家参考品的研制
目的 制备水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV) IgG抗体检测试剂的国家参考品.方法 利用国内外5个厂家ELISA试剂和膜抗原免疫荧光抗体检测(fluorescent-antibody-to-membrane-antibody,FAMA)试验,对候选样本进行筛选,确定水痘检测试剂国家参考盘;利用VZV WHO免疫球蛋白标准品对检测限参考品进行标定,通过不同厂家的协作标定终确定国家参考品的质量标准,并对其稳定性和均匀性进行考察.结果 参考品由8支阴性参考品、10支阳性参考品、1份重复性参考品和6支检测限参考品组成.质量标准为:阴性参考品符合率至少为7/8;阳性参考品符合率至少为9/10;检测限的浓度不高于127 mIU/ml;重复检测重复性参考品10次,其A值的变异系数不高于15.0％.该参考盘存放于不同条件下,相对稳定且均一性较好.结论 成功建立了1套用于评价VZV IgG抗体检测试剂盒国家参考品.
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弓形虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品的制备
目的 制备弓形虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品.方法 收集弓形虫IgG抗体阳性血清和正常人血清,用6个厂家的弓形虫IgG检测试剂盒进行筛选,并采用染色试验和凝集试验予以确证,采用弓形虫IgG抗体国际标准品对阳性血清进行标定.参考品经协作标定,确定低检出量标准.结果 确定此套血清国家参考品共24份,其中阳性参考品9份(包括低检出量参考品1份),阴性参考品15份.结论 制备了第1套弓形虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品,并建立了相应的质量标准,已被国家有关部门批准正式使用.
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第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制
目的研制第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品.方法从国内13省市几十万名供血员中筛选样品,用多种试剂对收集到的2 000多份血样进行复检,从中选出317份样品,用国外3种抗-HCV EIA试剂及国内4种抗-HCVEIA试剂进行检测,对可能被选入参考品的样品,再用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂,HCV RNA PCR试剂和CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证.利用HCV基因分型试剂对部分样品进行HCV基因型别检测,并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法确证.21个实验室会同标定.结果建立了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品及相应的质量标准.结论自2004年10月1日起,第5套抗-HCV国家参考品已被国家有关部门批准正式使用.
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HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的研制
目的 研制HIV-1 RNA血筛试剂国家参考品.方法 收集HIV-1病毒培养物、我国不同地区的HIV-1感染者血浆以及止常人样品,经HIV-1病毒载量试剂检测,对HIV-1 RNA阳性的样品进行env基因型分析,从中筛选参考品的候选样品.结果 共筛选8份HIV-1 RNA阳性的样品作为阳性参考品,病毒载量均高于5 000 IU/ml;8份HIV、HBV、HCV均为阴性的血浆样品作为阴性参考品;以1份病毒培养样品作为灵敏度参考品的原始样品,经WHO HIV-1 RNA标准品标定.其HIV-1病毒载量为3.79×104 IU/ml;反复3次冻融对参考品的病毒载量无明显影响.结论 已制备HIV-1 RNA血筛试剂国家参考品,为我国HIV-1核酸血筛试剂的质量控制和标准化提供了依据.
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第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品的研制
目的研制第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品.方法从国内11省市几十万名供血员中筛选出871份样品,以多种试剂对其进行复核,对备选参比品样品再进行免疫荧光吸收法检测,并对人类免疫缺陷病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、类风湿因子及非特异性抗体进行检测.根据样品复检及确证结果,选定30份样品,分装并分发至11个实验室,进行会同标定.结果已制备出第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品,并建立了相应的质量标准.结论第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品已被国家有关部门批准正式使用.
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第三批百日咳疫苗效力国家参考品的稳定性
第三批百日咳疫苗效力国家参考品(参苗#3)是在1980年由中国药品生物制品检定所与长春生物制品研究所合作,制备并冻干而建立的.其效力单位经与WHO的#2、我国的#2百日咳效力参考品标化,经过统计学处理得到其所标定的每安瓿18个国际效力单位(IU/安瓿).到目前为止,该批参考品从冻干之日起已有近20年,为此,我们对该批百日咳疫苗效力国家参考品的稳定性进行了分析和研究.
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柯萨奇病毒A组16型感染性滴度检测用国家参考品的制备及标定
目的 制备柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)感染性滴度检测用国家参考品,为CA16疫苗生产过程中的病毒滴度控制和CA16疫苗的免疫效果评价提供国家参考品.方法 将验证合格的CA16(C1亚型)培养液分装(0.5 ml/支)制成候选参考品.3个独立实验室分别对候选参考品进行协作标定,用细胞培养法检测CA16感染性滴度,用Behrens-K(a)rber法计算半数细胞感染量(50％ cell culture infective does,CCID50).同时,将CA16参考品分别置于-20、4、22～25(室温)和37℃条件下或反复冻融,进行热稳定性、长期稳定性和冻存稳定性研究.结果 制备的CA16参考品的病毒滴度为(6.80±0.95) lgCCID50/ml.CA16参考品于-60℃保存12个月、-20℃保存6个月和4℃保存28 d后的病毒滴度无显著下降,表明稳定性较好;在22～25℃(室温)和37℃条件下,CA16参考品每天的病毒滴度损失率分别为3.4％和4.4％,而且分别保存27和21 d后病毒滴度无明显下降;对CA16参考品反复冻融的病毒滴度损失率为4.8％/次.结论 成功制备了CA16感染性滴度检测用候选国家参考品,将CA16参考品赋值确定为(6.80±0.95) lgCCID50/ml.
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华支睾吸虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品的初筛
目的 建立华支睾吸虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品. 方法 2010-2012年,在广州进行华支睾吸虫病患者的粪检筛查,收集虫卵阳性者的血清26份.购买健康献血者血浆15份,每份200 ml.采用国内仅有的正在注册的2个华支睾吸虫IgG抗体检测试剂盒进行筛选和评价,确定参考品的组成,并进行分装精度测定和水分测定.选择3个单位对该参考品进行协作标定,检测血清参考品的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、低检出量. 结果 华支睾吸虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品包括9份阳性参考品,10份阴性参考品,1份低检出量参考品和1份精密性参考品.2次分装精度分别为0.6％和0.7％.2次水分检测结果均为2.8％.血清参考品的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率均为100％,低检出量均不高于1∶32. 结论 建立了华支睾吸虫IgG抗体检测试剂用血清国家参考品.
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抗-HCV酶免诊断试剂质量探析
抗-HCV酶免诊断试剂广泛应用于临床血液标本的检测,为了选择灵敏性高、特异性强、适合本实验室的试剂,本院对五个厂家的国产试剂进行了招标,采用检测丙型肝炎诊断试剂国家参考品与预期结果比较,运用2NCU/ML抗-HCV定值血清S/co值,并使用抗-HCV ELISA试剂进行漏检抗体谱分析的方法进行,以选择适合本实验室的试剂.
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艾滋病毒抗体国家参考标准建立
中国药品生物制品检定所国家“九五”科技攻关课题组不负众望，成功地建立了我国艾滋病病毒抗体国家参考品及标准，用于艾滋病病毒诊断试剂管理，从而有效阻止了国内外不合格试剂进入我国艾滋病检测系统。 面对艾滋病病毒的迅速传播，为确保高质量试剂用于我国各地的艾滋病检测，1996年“艾滋病病毒国家参考品及国产试剂质量提高”被列为国家“九五”重大科技攻关项目，由中国药品生物制品检定所负赍攻关。此后，该所科研人员在对北京、河南、广东、广西、四川、云南等地近20万高危人群筛查的基础上，从中选出2 000份样品再以3种试剂复筛，对368份检测结果阴阳不一致的样品用国内22个厂家试剂进行协同标定，然后用艾滋病病毒抗体确证试剂确证，终确定了阴、阳参考品，并根据各试剂检测结果制定出相应的标准。科研人员还通过对来自全国10多个省或地区的样品系统测定、确证，构建了总样品量为3 745份的评价血清库，用于试剂的质量评价。如此大的标准血清库目前世界上仅此一家。 大量事实表明，我国艾滋病病毒国家参考品及标准1997年10月正式确立实施以来，有力推动了国产诊断试剂的质量改进。1998年，国产艾滋病诊断试剂全面评价结果显示，其敏感性提高了约2～8倍，已超过国外同类试剂的水平。至今，我国投入使用的艾滋病合格试剂达1亿人份以上，对控制艾滋病病毒传播起到了重要作用。 据介绍，此项“九五”攻关成果，还指导促进了国产艾滋病诊断试剂由第二代间接法试剂发展到具有国际水平的双抗原夹心法试剂。用我国国家参考品及标准衡量，美国FDA批准上市的两种间接法试剂未能达标，而被拒绝进口。 (摘自《健康报》2000年10月3日第1版)
