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无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析
目的 建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性.方法 采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodex Ⅰ、在3L生物反应器中加入3 g/L cytodex Ⅰ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况.结果 建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4× 106个/ml,冻存前细胞活率为100％,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)％,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达大细胞密度20.5× 105个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,大μ值为0.025 4 h-1.Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P＞O.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P＞0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P＞0.05).在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好.结论 初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好.
关键词： 无血清无动物源性培养基 Vero细胞 传代稳定性 -
重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性
目的 通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性.方法 将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生化特性、质粒保有率、生长速度等的差异；取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA测序；诱导表达各代次菌株,比较各代次菌株的重组rLF蛋白的表达水平及免疫反应性.结果 各代次菌株菌落形态、生化特性、生长速度等方面与原始种子库无明显差异；在传至100代时的质粒保有率为76％；各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱未改变,未见lf基因变异；各代次菌株的总蛋白电泳图谱、rLF蛋白表达量、rLF蛋白的免疫反应性与原始种子库无明显差异.结论 重组大肠杆菌pET-28 (a)/LF/BL21具有较好的传代稳定性.
