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重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性检测方法的建立及验证
目的 建立重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)检测方法,并对其进行验证.方法 将系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体加入已接种表达CD52抗原的人淋巴瘤靶细胞中,再加入人血浆冻干补体后,采用ATP显色法定量检测靶细胞的活细胞数目.对试验条件进行优化,并对方法进行专属性、准确性、精密度、线性验证.结果 重组人源化抗CD52单克隆抗体在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D.方法经过优化后,确定人淋巴瘤RAMOS细胞为靶细胞,抗体稀释初浓度为120.μg/mL,稀释倍数为1∶1.4.不同浓度的无关抗体均对靶细胞无细胞毒性,方法专属性良好.理论CDC活性为50％、75％、100％、125％、150％的试样测定的相对CDC活性分别为(51.33±4.36)％、(75.80±6.31)％、(97.7±7.45)％、(133.27±10.7)％和(158.77±14.13)％,回收率均在80％～120％范围内,相对CDC活性和回收率的RSD均小于10％,方法准确性良好.将100％相对CDC活性试样重复测定6次,6次测定的相对CDC活性为(101.18±8.90)％,RSD小于10％,样品重复性良好.3个不同日期中同一实验员分别检测5个理论CDC活性为50％、75％、100％、125％、150％的试样的相对CDC活性的RSD均在10％以内,时间精密度良好.同一日期中2名不同实验员分别检测5个理论CDC活性为50％、75％、100％、125％、150％的试样的相对CDC活性的RSD均在10％以内,人员精密度良好.线性方程为y=1.065 6x-4.026,r2=0.983 7,线性良好.结论 成功建立了重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC检测方法,该方法具有良好的专属性、准确性、重复性、中间精密度和线性,可作为重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC活性的常规检测方法.
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抗CD52单克隆抗体外源DNA残留量检测方法的建立及验证
目的 建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证.方法 利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证.结果 该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量.专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70％～130％范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30％;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85％,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70％～ 130％范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71％.结论 该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量.
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CD52抗原的研究进展及其抗体在临床中的应用
人类CD52属于一个未命名的短链GPI锚定糖蛋白家族,其基因定位于人类1号染色体(1p36.1),分子量为25～29KD.广泛分布于淋巴细胞、单核细胞等造血细胞上和雄性生殖系统中的某些细胞表面,在造血干/祖细胞表面没有表达.由于①其具有在淋巴细胞和很多造血系统恶性肿瘤细胞上的高密度分布;②其分子交联化可引起一系列信号传导,从而导致细胞因子分泌,细胞增殖、生长抑制及凋亡;③其分子在细胞表面排列整齐、密度大,与抗体结合后结合补体的能力受抗体亚类影响较小等特点,抗CD52单克隆抗体(CAMPATH-1系列)已经被广泛地用于临床治疗.CD52分子自身直接的生物学功能目前还知之甚少,被人们利用的大部分都与其GPI锚定蛋白的特性相关.除CAMPATH-1系列抗CD52单抗以外,HI186因识别表位不同,其在生物学功能和临床应用上的差别值得关注.
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阿来珠抗体靶向治疗研究进展
近年来,免疫学靶向治疗在疾病的治疗尤其是肿瘤治疗中受到越来越多的关注,各种靶向性药物也逐渐被批准应用于临床或处于不同的临床试验阶段,其中抗C D分子单克隆抗体占相当数量.本文就临床应用较多的抗C D52分子单克隆抗体阿来珠近年来在临床治疗中的应用作简要综述,旨在引起对阿来珠在不同疾病中治疗作用的重视,也揭示其在多种疾病中存在有待挖掘的治疗潜力.
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成人急性淋巴细胞白血病单克隆抗体治疗的研究进展
ALL是一组异质性造血系统恶性肿瘤,不同亚型有着不同的生物学特性和预后,对治疗反应差别甚远.虽然近几年成人ALL的疗效有了长足的进步,然而,目前成人ALL长期无病生存率及治疗效果仍大大逊色于儿童ALL,复发、难治仍然是临床面临的难题,寻找新的治疗手段非常必要.急性淋巴细胞白血病原始细胞表面表达一系列作为单克隆抗体目标的特殊抗原,CD19、CD20、CD22和CD52.至今为止,CD20单抗已经与化疗联合治疗成熟B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)及Burkitt's淋巴瘤.另外一个抗原是CD19,在急性淋巴细胞白血病中呈高表达,Blinatumomab是双特异性单克隆抗体,可以直接对抗CD19和CD3.CD52单抗(阿仑单抗)、CD22单抗(依帕珠单抗)的有效性在一些小研究和个案报道中亦有显示.然而,有关单克隆抗体治疗使用方面,如:抗原表达所需达到的水平,何时开始以及何时结束治疗,单克隆抗体的佳剂量,单药治疗抑或联合治疗,是否需要维持治疗等,仍有待进一步明确.
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单克隆抗体治疗急性淋巴细胞白血病
近年来,肿瘤细胞的单克隆抗体靶向杀伤已成为肿瘤治疗的发展趋势之一.譬如急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞表面表达各种特异性抗原CD19,CD20,CD22和CD52等,引发了以这些靶点为目标的新型药物研发.现将就blinatumomab,利妥昔单抗(rituximab),依帕珠单抗(epratuzumab),inotuzumabozogamicin,阿伦单抗(alemtuzumab)等单抗治疗ALL的临床及临床前研究进行综述.
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阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体的电荷异质性
目的 建立阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)电荷异质性的方法,并对其进行验证.方法 基于mAb等电点呈弱碱性,且因为抗体所带电荷的不同导致其与色谱柱结合力的不同,采用"PropacTM WCX-10"弱阳离子交换柱,利用盐梯度洗脱的方法依次洗脱出mAb的酸性电荷变异体、中性电荷变异体及碱性电荷变异体;对方法的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性进行验证.结果 阳离子交换高效液相色谱分析重组人源化抗CD52 mAb各电荷变异体的保留时间在14～21 min之间,其中酸性电荷变异体的保留时间在14～17 min,中性电荷变异体的保留时间在17～18 min,碱性电荷变异体的保留时间在18～21 min之间.专属性验证显示空白辅料对照色谱图在样品出峰位置无干扰.线性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体相关系数R2均>0.99.准确性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体回收率分别为99.3％～99.9％、99.8％～100.4％和99.3％～99.7％.仪器重复性、样品重复性和中间精密度验证中,各电荷变异体的RSD均<5％.耐用性验证中,流动相pH在8.0±0.1、流动相中盐浓度为100 mmol/L±5 mmol/L、柱温在(30±2)℃变化时各电荷变异体的RSD均<5％.结论 阳离子交换高效液相色谱可以有效分离重组人源化抗CD52 mAb的酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体,且该方法具有良好的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性.
关键词： 阳离子交换高效液相色谱 CD52 单克隆抗体 电荷异质性
