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一种改进型基于荧光蛋白重定位系统的丙型肝炎病毒滴度检测方法的建立
目的 建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度.方法 通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸(C462-540)的基因序列及含有SV40核定位信号的IPS-1 (C462-540)基因序列,插入经同样酶切的慢病毒表达载体LV-CAG--EGFP-WPRE、LV-CAG-mCherry(RFP)-WPRE,构建表达EGFP-IPS-1 (C462-540)、RFP-NLS-IPS-1 (C462-540)的慢病毒重组表达质粒;在此基础上构建含有IPS-1(C462-540)-2A-EGFP-puro、IPS-1(C462-540)-IRES-EGFP-puro的慢病毒重组表达质粒;利用293T细胞包装含有IPS-1 (C462-540)蛋白的重组慢病毒;感染Huh7.5细胞,流式细胞仪筛选稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的Huh7.5细胞,或用puromycin筛选稳定表达EGFP的Huh7.5细胞;利用10倍系列稀释的HCV感染上述细胞,检测HCV的滴度.结果 测序表明4种慢病毒表达质粒构建正确;收获的慢病毒感染Huh7.5细胞48 h后,可见EGFP或RFP表达,经流式细胞仪分选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-IPS-1(C462-540)的细胞系,经puromycin筛选获得了稳定表达EGFP-IPS-1 (C462-540)的细胞系;经10倍系列稀释的HCV感染后,弥散在细胞质中的点状EGFP、RFP会扩散到整个细胞或定位到细胞核中,在甲基纤维素的限制下形成明显的荧光噬斑点,通过计算荧光噬斑点数得到用Huh7.5-EGFP-IPS-1(462-540)-IRES-PURO、Huh7.5两种细胞检测的HCV滴度分别为(5.6±0.2)×105和(5.5±0.2)×105 PFU/mL,二者无显著差异.结论 成功构建了含有绿色荧光或红色荧光报告系统的细胞系,建立了一种简单、快速检测HCV滴度的新方法.
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双核酶自切割HCV全基因组复制子的构建及其体内外复制的特性
目的 建立可在细胞内直接启动HCV复制并且能产生感染性病毒颗粒的HCV全基因组复制子,进行HCV体内外实验研究. 方法 在HCV JFH1及JFH1/GND cDNA序列两侧分别加上核酶序列与pcDNA3.1载体构建重组质粒pcDNA3.1-RZ-JFH1和pcDNA3.1-RZ-JFH 1/GND.用重组质粒直接转染Huh7.5细胞及进行昆明小鼠尾静脉高压注射.定量实时逆转录聚合酶链反应、细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色和血清学检查分别检测其体内外复制的特性.结果 在16周的检测期内,从转染HCV复制子的Huh7.5细胞培养上清液中持续稳定地检测出1×106 ～3 × 106拷贝/ml的HCV RNA(非稳定转染),产生的病毒颗粒具有感染性.在尾静脉高压注射HCV复制子的昆明小鼠,检查到短暂的病毒血症,免疫组织化学染色未能发现HCV抗原阳性细胞,未检测到血清中HCV特异性抗体.结论 构建的HCV复制子在体外能长期、稳定及高效的产生感染性病毒颗粒,但体内实验未能获得预期效果,可能与HCV JFH1病毒株的特殊性有关.所建立的HCV全基因组复制子可用于HCV病毒学及抗病毒药物筛选等方面的研究.
