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Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化
目的 优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求.方法 向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3h),经100 kD超滤离心管,用不同pH(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩.将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态.结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA.结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5h后,用pH为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99％以上.Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰.在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准.结论 非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Veto细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础.
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Benzonase酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗动物安全性评价
目的 对Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗进行动物安全性评价.方法 依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》,对经Benzonase酶处理的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行豚鼠全身主动过敏性试验、体外溶血性试验、大鼠急性毒性试验和家兔肌肉刺激试验,评价疫苗的安全性.结果 狂犬病疫苗豚鼠过敏反应发生率为50％,5 min后恢复正常;体外溶血结果为阴性;大鼠急性毒性试验未见异常;家兔肌肉刺激性试验在注射部位肌肉局部出现了极轻度到轻度的间质炎性细胞浸润、肌肉组织变性坏死及间质纤维组织增生,给药后2周,上述病变程度明显缓解.结论 利用Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗(酶残留量低于0.2 ng/ml)安全性良好,不影响其临床使用.
关键词： 狂犬病疫苗 Benzonase酶 Vero细胞 DNA 安全性 -
Benzonase酶对金黄色葡萄球菌生物膜的影响
目的 研究Benzonase酶对金黄色葡萄球菌eDNA的降解作用,并对生物膜含量及其内细菌数量的影响.方法 凝胶电泳分析Benzonase酶对eDNA的降解作用;结晶紫染色测吸光值(A570)观察生物膜含量的变化;平板菌落计数法检测生物膜内细菌数量的变化;光镜下观察生物膜形态的变化.结果 Benzonase酶能将eDNA完全降解;当酶浓度超过0.2 U/ml时,生物膜的含量和其内细菌数量下降不再发生变化;光镜下生物膜的形态发生明显变化.结论 Benzonase酶能高效降解eDNA,极微量浓度的Benzonase酶就可以使金黄色葡萄球菌生物膜的含量和其内的细菌数量大幅下降.
关键词： 金黄色葡萄球菌 细菌生物膜 Benzonase酶 胞外DNA
