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Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性
目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性.方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白.以SDS-PAGE、ESI-MS和Western blot法鉴定其纯度及特异性.以细胞透射电镜、DNA Ladder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性.结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22 000,纯化后纯度95%.Western blot证实为TRAIL蛋白.电镜、DNA Ladder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性.结论 Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 Pichia酵母 生物活性 -
VEGF受体KDR克隆及其对内皮细胞增殖和血管新生的影响
目的:克隆VEGF受体KDR基因膜外5-7区,探讨其生物学活性.方法:提取脐静脉血管内皮细胞总RNA,克隆KDR基因膜外部分5-7区,并使之在QIA表达系统进行表达;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定.结果:该系统能表达KDR基因片段,表达量约占菌体蛋白总量的5%左右.经复性,可溶性蛋白具有与VEGF特异结合功能,并能抑制VEGF促使脐静脉内皮细胞增殖和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用.结论:KDR基因片段能在QIA表达系统中得到表达,复性后表达蛋白具有与VEGF结合的生物学功能.
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兔Oddi氏括约肌细胞BK 通道Alpha亚基在Pichia酵母中的高效表达、纯化和鉴定
目的用巴斯德毕赤酵母系统表达兔Oddi氏括约肌(SO)细胞BK 通道α亚基,并进行纯化和鉴定.方法采用RT-PCR扩增编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,经测序正确将其克隆入酵母表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115.经MD平板筛选重组子、G418筛选鉴定后,甲醇诱导表达,镍离子亲合层析法对表达上清进行纯化,进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果用RT-PCR扩增出约1 497 bp的兔SO细胞BK通道α亚基基因的cDNA.序列分析显示,扩增序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道α亚基的cDNA序列完全一致.SDS-PAGE显示本系统表达的α亚基融合蛋白Mr约为55 000,表达量约为55 mg/L,纯度为96%.Western blot检测证明,该α亚基融合蛋白可与兔BK 通道α亚基多克隆抗体特异性结合.结论克隆了编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,并在毕赤酵母中成功地表达了该蛋白,为进一步研究BK通道提供了物质基础.
关键词： Pichia酵母 BK 通道Alpha亚基 分泌表达
