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人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定
目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionine β-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测.方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS.经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白.结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS).再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19mg/L培养物),并测得其比活力约为57kU/g.结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础.
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日本血吸虫新基因-Ⅲ8kDa钙结合蛋白基因的发现与克隆
目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因-Ⅲ8kDa钙结合蛋白(Calcium-binding protein, CBP) cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步对该基因的功能进行研究做准备.方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫钙结合蛋白cDNA高度同源. 根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物, 将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjCBP基因亚克隆入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中. 结果所发现的新基因与曼氏血吸虫8kDa CBP基因的同源性达82%, PCR产物的片段长度与预期大小一致, 重组T载体及表达质粒经EcoRI及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段. 结论所发现的cDNA与曼氏血吸虫8kDa CBP cDAN高度同源, 并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjCBP.
