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转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗侵袭性和生长活性初步检测
目的:探讨经60Co处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性变化.方法:体外培养三种肝癌细胞(①野生型HepG2肝癌细胞②转染hGM-CSF基因的HepG2肝癌细胞③60Co射线处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗)采用MTT方法检测三种细胞在24h、48h、72h的OD值并绘出生长曲线;利用transwell小室进行体外侵袭实验来观察上述三种细胞侵袭性:用RT-PCR技术检测上述三种细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)在mRNA水平上表达的变化;结果:经60Co照射处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗组OD值在相同培养时间点较其他两组明显变小且差异有显著性(P<0.05).三种细胞(上述①②③种细胞)transwell侵袭试验显示:③组穿过人造基底膜的细胞数量明显少于前两组;PT-PCR示:③组细胞的MMP-2的mRNA的表达明显低于①②.结论:经过60Co处理过的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性均明显降低.
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PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达
目的 采用长度为245 bp的急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因片段构建新的PML-RARα与hGM-CSF真核双表达载体.方法 用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增长度为245 bp的PML-RARα基因片段,PCR技术从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点A和B中,构建真核双表达载体.用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将重组质粒转染K562细胞,利用RT-PCR和点杂交技术检测重组质粒在真核细胞中的转录和翻译情况.结果 双酶切结果证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列完全正确.该重组质粒能够在真核细胞中正常转录和翻译.结论 成功构建了含有PML-RARα245及hGM-CSF的双表达载体,为筛选合适的抗原片段用于构建治疗急性早幼粒细胞白血病的PML-RARαDNA疫苗提供重要资料.
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HA 转 hGM-CSF HepG2疫苗对 IL-6诱导 HepG2细胞 EMT的影响及机制
目的：探讨 HA 转 hGM-CSFHepG2疫苗逆转 IL-6诱导 HepG2肝癌细胞上皮-间质转化（EMT）的机制。方法：体外用 HA 转 hGM-CSFHepG2疫苗共培养受 IL-6刺激的 HepG2细胞，采用 Traswell 迁移实验，Western-blot、RT-PCR 方法分别检测疫苗处理前后 HepG2细胞的增殖及侵袭能力的变化、EMT 标志物 E-cadherin、调控因子（p-Stat3、Twist）蛋白及 E-cadherinmRNA、TwistmRNA 表达变化情况。结果：① IL-6组较阴性对照组穿膜细胞数明显增多，侵袭能力明显增强，差异有统计学意义。② IL-6组较阴性对照组 E-cadherin 的表达水平降低， p-Stat3、Twist 蛋白表达升高，差异均有统计学意义。③疫苗组的穿膜细胞数较其他三组明显减少，侵袭能力下降，差异均有统计学意义。④转染后的疫苗组较其他三组 E-cadherin 蛋白表达升高，而 p-Stat3、Twist 蛋白表达下降，且差异均有统计学意义。⑤疫苗组较其他三组 E-cadherinmRNA 表达上调、TwistmRNA 表达下调，且差异均有统计学意义。结论：① IL-6能诱导 HepG2细胞产生 EMT 现象。②60Co 处理的转 hGM-CSF 基因 HepG2疫苗可能通过下调转录因子 Twist及 Stat3的表达进而逆转 IL-6诱导 HepG2细胞 EMT。
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PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建
目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础.方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体.利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.结果:Nhe I/Mlu I和Xba I/Sal I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确.结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体.
关键词： PML-RARα基因 hGM-CSF基因 早幼粒细胞白血病 DNA疫苗
