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DC-CIK对K562/A多药耐药基因mdr1表达的影响
目的:体外观察树突状细胞(dendritic cell,DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine inducedkiller,CIK)对K562/A细胞株多药耐药基因mdr1表达的影响.方法:采集健康人的外周血,分离出单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在体外加入多种细胞因子经诱导生成DC及CIK细胞,以流式细胞仪检测其表面标志,将DC细胞内加入K562/A细胞裂解物致敏后,再与CIK细胞混合培养48小时.将致敏后的DC-CIK细胞与K562/A及K562分组培养后以荧光定量PCR检测其mdr1基因表达的情况,PBMC作为对照组.结果:RT-PCR中可见K562/A+DC-CIK组中mdr1 mRNA表达较K562/A明显降低,经荧光定量PCR观察到K562/A内mdr1 mRNA表达为K562的10.27倍、K562/A/PBMC略低于未处理的K562/A (P＞0.05),K562/A/DC-CIK细胞中mdr1 mRNA含量较K562/A、K562/A/PBMC少(P＜0.05).DC-CIK细胞与细胞株混合培养后,mdr1基因表达较混合培养前明显降低.结论:实验数据显示DC-CIK可使耐药细胞株内mdr1基因表达下调.但K562与DC-CIK混合培养后该基因降低不明显,提示该基因在细胞中存在着基础表达,意义在于维持细胞内稳态.目前针对逆转白血病耐药的研究较少,需要多进行相关研究以拓宽细胞免疫治疗在逆转耐药领域的应用.DC-CIK是具有发展潜力的抗肿瘤方法.本实验将为下一阶段研究逆转耐药的机制提供依据,DC-CIK细胞免疫疗法有望成为逆转肿瘤耐药的新方法.
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人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA的构建及功能研究
目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能.方法:人工合成编码mdrl小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达栽体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基因阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blotting检测转基因细胞中mdrl基因的表达量,MTT法检测转基因细胞对阿霉素的敏感性.结果:RT-PCR结果显示,与未转基因组和阴性对照组比较,RNA干扰组mdrl基因在mRNA水平上表达量降低43.55%;Western Blotting检测显示,RNA干扰组mdrl基因在蛋白水平上表达量降低69.46%;MTT法检测显示mdrl干扰细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性提高23倍.结论:mdrl小发夹状RNA可显著抑制K562/A细胞中的mdrl基因的表达,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,对白血病多药耐药性的逆转和白血病的治疗具有重要理论和实际意义.
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用于耐药肿瘤细胞代谢组学的细胞内核苷类组分离子对色谱分析法
目的:建立测定K562及K562/A细胞内核苷类代谢物含量的高效液相色谱法,用于两者代谢组学研究.方法:采用1.2 mol·L-1HClO4沉淀蛋白,用苯硼酸柱进行固相萃取富集样品中的核苷酸.色谱柱为汉邦C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相由两种缓冲液组成,梯度洗脱,流速为0.8 mL·min-1.A相缓冲液含10 mmol·L-1四丁基氢氧化铵,10 mmol·L-1KH2PO4及0.25%甲醇,pH7.0;B相缓冲液含5.6 mmol·L-1四丁基氢氧化铵,50 mmol·L-1KH2PO4及30%甲醇,pH7.0.柱温25℃,检测波长260 nm.结果:各种核苷类代谢物分离良好,内源性物质无干扰,K562及K562/A细胞内核苷类代谢物平均回收率分别为88.3%～109.2%、84.5%～115.6%.结论:该法简便及重现性好,可同时测定肿瘤细胞中核苷、单核苷酸、二核苷酸及三核苷酸含量.分析结果表明,K562与K562/A细胞核苷类代谢物组存在明显差异.
