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立氏立克次体外膜蛋白H基因片段的克隆表达与免疫原性分析
目的:克隆表达立克立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析.方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段.将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因.结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低.结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白H原核表达、多克隆抗体制备及免疫保护作用
目的 为铜绿假单胞菌外膜蛋白H(OprH)工业发酵与疫苗开发研究奠定基础.方法 采用分子克隆技术构建OprH蛋白的表达菌株,通过正交试验设计筛选OprH菌株的佳培养条件与表达条件.利用切胶纯化获得OprH蛋白并免疫小鼠,制备OprH蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度,蛋白质印迹法检测抗血清特异性;对小鼠免疫OprH蛋白,攻毒铜绿假单胞菌,检测蛋白的免疫保护作用.结果 OprH重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致.OprH菌株佳培养条件为转速230 r/min,葡萄糖浓度0％,装液量50 mL;佳诱导表达条件为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度0.3 mmol/L,诱导时菌液D600值0.8,温度32℃,诱导时间3h.ELISA法获得OprH抗血清滴度达1:1 600,蛋白质印迹法证实抗血清具有很好的特异性.OprH免疫小鼠激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到46.15％,与对照相比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建OprH表达载体,纯化获得OprH蛋白,制备OprH蛋白多克隆抗体,实验结果表明OprH蛋白对小鼠铜绿假单胞菌感染具有免疫保护作用,并获得OprH蛋白菌株的佳培养条件与表达条件.
