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高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响
目的:探究高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响,为研究NYD-SP15在生物体中的功能提供动物模型.方法:将人源NYD-SP15 cDNA以及Cre序列插入PCAG启动子下游,构建NYD-SP15转基因表达载体,并通过原核注射,构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配,PCR鉴定转基因小鼠是否有Cre插入,筛选出人源NYD-SP15表达的小鼠,统计转基因小鼠体重变化和后代阳性情况.结果:通过PCR鉴定及公司测序验证,我们成功构建了NYD-SP15转基因过表达载体.并通过PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以表达人NYD-SP15的转基因小鼠.比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现转基因小鼠体重与同窝野生型小鼠相比无明显区别,说明在体内过表达NYD-SP15对小鼠体重无明显影响.通过对后代阳性小鼠出生情况统计发现F2代阳性小鼠出生率较F1代明显降低.结论:人源NYD-SP15在小鼠体内能正常表达,对其生长无明显影响,但其后代阳性出生率呈逐代下降趋势,推测该原因可能与NYD-SP15在睾丸中表达有关.
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NYD-SP15基因的原核表达及多克隆抗体的制备
目的:克隆NYD-SP15基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体.方法:PCR技术扩增NYD-SP15全长开放阅读框,克隆入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳.将此融合蛋白Ni柱纯化后免疫BALB/C小鼠,Western blotting鉴定.结果:成功地构建了PET28a-NYD-SP15原核表达质粒,并获得了高效表达NYD-SP15的BL21菌株,表达的His标签融合蛋白,分子量为58kDa左右,经免疫小鼠获得了抗NYD-SP15抗体.经Western blotting法分析,抗体为NYD-SP15特异性抗体.结论:构建的NYD-SP15基因的原核表达载体,体外高效表达蛋白,免疫小鼠获得抗NYD-SP15抗体,将为眼部增殖性视网膜病变(PVR)的研究及治疗奠定坚实的基础.
