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抗微生物肽——颗粒溶解素的研究进展
颗粒溶解素是新近发现的一种毒性分子，具有广谱的抗病原微生物及杀伤肿瘤细胞作用，其作用机制涉及神经酰氨和caspase依赖和非依赖途径，并与其二级结构及所带正电荷氨基酸相关。由于其广谱的抗病原微生物作用及对正常宿主细胞的低毒性，所以它在消除耐药性病原微生物方面是一种很有吸引力的生物制剂，已成为抗微生物肽研究的一个新热点。
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肺结核患者外周血NK细胞数量和胞内杀伤分子的变化
目的:检测初治和复治结核病患者外周血NK细胞数量和胞内杀伤分子的变化.方法:取健康人(112名)和结核病患者145例(初治105例,复治40例)抗凝外周全血标本,加荧光标记抗CD3、CD56、CD8、颗粒酶和穿孔素抗体进行标记,进行流式细胞术检测.结果:初治肺结核患者外周血NK细胞的比例(16.95±8.27)%显著低于健康组(19.99±9.28)%(P<0.01).健康组外周血NK细胞绝对值计数为(44.32±26.69)×104/ml,结核初治组为(33.31±21.44)×104/ml,复治组为(36.8±24.97)×104/ml,结核初治组明显低于健康组(P<0.01).结核病患者NK细胞中表达颗粒溶解素(85.78±11.63)%,穿孔素(82.88±17.05)%,颗粒酶(79.07±15.64)%,健康组(87.31±10.34)%、(82.85±13.03)%、(88.04±7.27)%,2组颗粒溶解素和穿孔素差异均无统计学意义(P>0.05),而颗粒酶差异有统计学意义(P<0.01).结论:初治组结核病患者外周血NK细胞数量明显降低,但NK细胞中颗粒溶解素、穿孔素的表达和健康组差异均无统计学意义.
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GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析
目的:纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性.方法:将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化.同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性.结果:GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44 kDa的单一蛋白条带.经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显.结论:成功纯化CST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性.
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人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达
目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA,克隆到pGEM-T载体,测序正确后,再亚克隆到质粒pGEX-4T1中,构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin,并转化大肠埃希菌DH5α,诱导GST-granulysin融合蛋白表达.结果:诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后,免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44 000的蛋白条带.结论:获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础.
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Granulysin真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定. 结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达. 结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础.
