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人可溶性TRAIL基因的克隆及表达
为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白,应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA,克隆入PCR2.1载体,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体.将重组质粒分别转入C0S-7和大肠杆菌M15中表达.用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定大肠杆菌中的表达产物.所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子,相对分子质量为21 000,表达量约为2mg/ml.所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL-60细胞凋亡的作用.上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料.
关键词： 人可溶性TRAIL蛋白 融合蛋白 大肠杆菌表达 -
重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨
目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理.方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性.结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26%～57%.不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5%,而诱骗受体DcRl表达55%,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40%～88%),而DcRl表达很低(8%～17%).rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高.ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性.结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关.
关键词： 人可溶性TRAIL蛋白 细胞凋亡 Caspase-3 诱骗受体 死亡受体
