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模式识别分子mindin在体外HCV全基因组转染的Huh-7和Huh-7.5细胞系中表达下调
目的 研究模式识别分子mindin在体外HCV感染细胞系的表达状况.方法 在体外将全长HCV嵌合体基因组电转染到Huh-7和Huh-7.5细胞中,用间接免疫荧光观察转染48 h后HCV核心蛋白表达,用Western印迹方法检测转染72 h后细胞内mindin蛋白水平的变化.结果 HCV核心蛋白在转染细胞中表达,在未转染的细胞中不表达；与未转染细胞相比,转染72 h后细胞内mindin蛋白水平降低.结论 HCV感染下调肝细胞mindin表达,mindin可能参与HCV致病过程.
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丙肝病毒全基因组克隆转染细胞体系的初步研究
采用一种含有HCV全基因组和噬菌体T7启动子和终止子序列的载体(pHCV)转染Vero-E6细胞,随后感染高效表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒(vTF7-3),通过vTF7-3的辅助作用,使Vero-E6细胞高效增殖HCV病毒体,建立了一种新的HCV体外细胞培养体系.RT-PCR、荧光定量PCR检测转染细胞裂解液中HCV滴度的结果显示:pHCV转染细胞内HCV基因拷贝达107-108/mL,同时有HCV正链RNA合成;免疫印迹显示该培养体系中有HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达;pHCV转染细胞经透射电镜观察,可见清晰的HCV病毒体,直径在40-50nm.这一新体系的初步建立,为研究HCV的复制机制、制备HCV疫苗和研发抗病毒药物奠定了基础.
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基于pJFH-1的HCV全基因组扩增方法的建立
目的 基于pJFH-1建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方法.方法 以pJFH-1为测试模板,通过优化PCR扩增中各个重要环节,包括引物的选择、甘油和/或DMSO适浓度的筛选、循环条件的摸索等,建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案.结果 高Tm值(＞65 ℃)的引物更有利于HCV全基因组的扩增;5%、10%甘油或5% DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率,且甘油的促进作用优于DMSO;双温法较三温法能获得更高产量的PCR产物.结论 通过优化长链PCR反应体系及条件,成功实现HCV基因全长的扩增.
