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pGC-FU-存活素慢病毒表达质粒的构建
目的 构建pGC-FU-survivin慢病毒质粒,旨在下一步实验中利用survivin蛋白的表达影响原代肝细胞的增殖.方法 从高表达survivin的小鼠淋巴瘤细胞株YAC-I中获取存活素(survivin)基因,连接到pcDNA3.1(+)质粒上,双酶切及双向测序鉴定.构建pGC-FU-survivin慢病毒载体,从基因水平和蛋白质水平鉴定含有survivin的目的片段表达.经包装、纯化,获得效价较高的病毒颗粒进行下一步生物学功能研究.结果 双酶切及测序证实从YAC-I中获得的survivin基因连接到pcDNA3.1(+)质粒上,除第317位碱基由腺苷酸突变为胸腺嘧啶外,其余均与NCBI基因文库中survivin基因切合,该突变不影响蛋白质空间结构及蛋白质生理功能.构建pGC-FU-survivin表达质粒的阳性克隆菌株转染293T细胞后,荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Western blot结果见一与标准品大小相同的条带.在293T细胞中进行病毒包装,终纯化出pGC-FU-survivin慢病毒颗粒.结论 借助T载体及pcDNA3.1(+)质粒,成功地在pGC-FU慢病毒表达质粒上建立了pGC-FU-survivin慢病毒表达质粒.
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携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建
目的 构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH.方法 酶切载体pGC -FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper 1.0和pHelper 2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功.结果 菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735 bp,阴性转化子198 bp基本相吻合；PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功.分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒( pGC- FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU /PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48 h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功.结论 成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础.
