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刚地弓形虫微线蛋白16基因片段原核表达、纯化及免疫反应性分析
目的 原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)微线蛋白16(micronemal protein 16,TgMIC 16)的3个基因片段,并分析3个重组蛋白的免疫反应性. 方法 参照GenBank中TgMIC16基因序列,根据功能活性区将其分为3个片段(MI6D1、MI6D2、MI6D3),分别设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR扩增,获得预期的3个DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pET-32a(+),将重组质粒转化人大肠埃希菌(Escherichia coli)TOP10,经PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosetta,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物.重组蛋白经镍柱纯化后,分别以抗组氨酸(His)单抗和弓形虫感染兔血清为一抗,Western blotting分析其免疫反应性. 结果 TgMIC 16 3个基因片段的RT-PCR扩增产物分别为1 806、1 290、855 bp.双酶切和测序结果显示,3个TgMIC16片段的重组表达质粒构建成功.SDS-PAGE分析结果显示,3个重组蛋白成功表达,且均为以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)分别为88 000、68 000、52 000.Western blotting分析结果显示,3个纯化的表达蛋白均能被抗His单抗和弓形虫感染兔血清识别. 结论 成功构建并表达TgMIC l6的3个功能活性区,且3个重组蛋白均表现出良好的免疫反应性.
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弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备纯化及其在亚细胞定位中的应用
目的 制备并纯化弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位.方法 利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测抗体效价和抗体特异性.用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维(HFF)细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光(IFA)检测TgMIC16在感染细胞中的定位.结果 间接ELISA结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1:512000;Western blotting结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体.结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位.
