首页 > 文献资料
-
豆状带绦虫肌动蛋白基因克隆及其作为分子内参的应用
目的 克隆豆状带绦虫(Taenia pisiformis)肌动蛋白基因(Tp-actin)全长cDNA,分析其基因结构、系统进化及作为内参基因的适用性.方法 采用RT-PCR法扩增Tp-actin基因片段,RACE-PCR法获得3'和5'端cDNA序列,分别测序后拼接Tp-actin全长cDNA.利用生物信息学软件进行基因结构和系统进化分析.应用Primer Express软件设计Tp-actin和豆状带绦虫组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶基因(TpCP)的特异性引物,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测引物特异性和Tp-actin基因扩增效率,并以Tp-actin作为内参基因,分析TpCP在豆状带绦虫六钩蚴、囊尾蚴、成熟节片和孕节片等不同发育阶段组织中的表达特征.结果 测序结果显不,Tp-actin基因片段为1 048 bp,3 '和5'端基因片段分别为428和945 bp,与预期结果一致.拼接获得的Tp-actin全长cDNA为1 279 bp,其中3'UTR长118 bp,5'UTR长30 bp,开放阅读框为1 131 bp,序列已提交GenBank(登录号为JX624787).生物信息学分析结果显示,该序列编码376个氨基酸,推测蛋白相对分子质量(Mr)为41 749,等电点为5.29,含6种特定功能位点和3个actin蛋白家族特征位点.系统进化分析显示,Tp-actin序列与猪带绦虫(Taenia solium)和枝形裂头绦虫(Diphyllobothrium dendriticum)的同源性分别为100％和99.7％.qRT-PCR结果显示,Tp-actin和TpCP基因经特异性引物扩增,分别获得82和108 bp片段,与预期结果一致;Tp-actin和TpCP基因熔解曲线均呈单一信号峰,引物特异性强;Tp-actin基因标准曲线线性相关系数(R2)为0.999,符合qRT-PCR对扩增效率的要求;以Tp-actin基因为内参基因,TpCP基因在孕卵节片中相对转录水平比值为1.65,显著高于六钩蚴(1.00)、成熟节片(0.87)和囊尾蚴(0.62) (P＜0.05).结论 Tp-actin基因高度保守,可作为豆状带绦虫基因表达调控及量化分析的内标参照.
