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Fms样酪氨酸激酶3配体联合CpG和肿瘤抗原治疗肿瘤的研究
背景与目的:Fms样酪氨酸激酶3配体(fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FLT3-L)、CpG虽可作为免疫调节剂发挥抗肿瘤作用,但单独用于治疗肿瘤效果不佳.本研究旨在探讨FLT3-L+肿瘤抗原+CpG联合应用对肝癌小鼠的治疗效果及机制,并探讨FLT3-L与GM-CSF在肿瘤治疗效果方面的差异.方法:选择小鼠H22肝癌模型为研究对象,分为FLT3-L+CpG组、GM-CSF+CpG组和PBS组.皮下注射给药后,用流式细胞术检测各组小鼠体内免疫细胞激活情况,免疫组化法检测肿瘤组织及局部细胞浸润情况,ELISA法检测小鼠体液免疫激活情况,同时观察各组小鼠生存期的差异,评价各组药物的抗肿瘤效果及可能的作用机制.结果:(1)FLT3-L+CpG组小鼠肿瘤生长明显被抑制,小鼠生存期显著延长,同GM-CSF+CpG组和PBS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).(2)脾脏淋巴细胞亚群分析显示,FLT3-L+CpG组CD3+T细胞比例显著上升,CD4+、CD8+亚群比例较PBS组与GM-CSF+CpG组均明显上升,CD4+CD25+Treg细胞比例明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)肿瘤组织形态学分析显示,FLT3-L+CpG组可见大片的组织坏死和显著的淋巴细胞浸润.(4)肿瘤局部浸润淋巴细胞表型分析显示,FLT3-L+CpG组肿瘤局部NK细胞、DC细胞、CD8+T细胞明显增加,较各治疗组均有明显变化,与PBS相比差异有统计学意义(P＜0.05).(5)FLT3-L+CpG组与GM-CSF+CpG组小鼠体内细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-2、IL-12均明显升高(P＜0.05).结论:FLT3-L+肿瘤抗原+CpG联合应用可发挥明显的抗肿瘤作用.此方案可能通过打破肿瘤免疫耐受,激活和增加循环中T细胞,并趋化NK细胞、DC细胞、CD8+T细胞到肿瘤局部,发挥杀伤肿瘤细胞的作用；同时可活化免疫因子网络,通过细胞免疫和体液免疫共同发挥抗肿瘤作用.
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构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达
目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.
关键词： fms样酪氨酸激酶3配体 胞外域 原核表达 组氨酸标签 -
60Coγ射线全身照射后大鼠血浆中GDF-15、Flt-3L和SAA表达的剂量相关性研究
目的:探讨钴60(60Co)γ射线照射对SD大鼠血浆中Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和生长分化因子-15(GDF-15)蛋白表达情况的影响.方法:将72只SD大鼠按照不同照射剂量分为0 Gy组、1 Gy组、3 Gy组和5 Gy组,每组18只,采用60Coγ射线照射大鼠,剂量率为1 Gy/min.照射后1 d、3 d和5 d采集4组大鼠外周血,通过酶链免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中的Flt-3L、SAA和GDF-15蛋白表达水平.结果:SD大鼠血浆中的Flt-3L和GDF-15蛋白在照射后表达升高,升高的水平与辐射剂量相关.3 Gy组和5 Gy组血浆中的GDF-15蛋白在照射后1 d、3 d和5 d与0 Gy组相比表达均增高,差异有统计学意义(t=3.09,t=6.32,t=8.91,t=10.71,t=2.73,t=6.64;P<0.05);5 Gy组血浆中的Flt-3L蛋白在照后1 d、3 d和5 d与0Gy组相比表达均增高,差异有统计学意义(t=4.22,t=8.48,t=5.51;P<0.05);3 Gy组Flt-3L蛋白只在照后1 d和5 d表达增高,差异有统计学意义(t=5.79,t=3.69;P<0.05);GDF-15蛋白水平在照射后1 d的剂量-效应关系(R2=0.936,P<0.05)优于照射后3 d和5 d(R2=0.913,R2=0.887;P<0.05);Flt-3L蛋白正相反,其在照射后5d的剂量-效应关系好(R2=0.965,P<0.05);SAA只有在照射后1 d有随剂量升高表达增加的趋势.结论:血浆中的Flt-3L和GDF-15蛋白在全身照射的大鼠血浆中特定时间点呈现出比较良好的剂量-效应关系.
