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羧肽酶A1及其活性中心基因的表达及活性分析
目的:克隆羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体进行诱导表达,分析表达产物活性.方法:RT-PCR扩增CPA1全酶及活性中心基因,测序分析后将目的基因克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实插入方向正确后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的基因后SDS-PAGE电泳分析.目的蛋白经变性、复性、纯化后MTT法和集落形成试验鉴定其活性.结果:获得了人CPA1全酶及活性中心基因,目的基因诱导表达后约66 kD及46 kD处可见新生蛋白带;活性分析显示CPA1全酶和活性中心蛋白都具有一定的催化水解活性,但后者对肿瘤细胞的杀伤效果较弱.结论:能成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因,获得了二者的原核表达产物,体外具有一定活性.可望以人羧肽酶A1全酶及其活性中心基因为新起点,继续完善优化羧肽酶A1系统,为抗体靶向治疗前列腺癌的临床应用奠定基础.
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人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达
目的: 克隆人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1, CPA1)活性中心基因,构建重组表达载体并对其进行诱导表达. 方法: 通过RT-PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因,克隆入载体pGEM-T easy,测序分析. 将该目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组蛋白. 结果: 获得了人CPA1活性中心基因,构建了重组表达质粒,表达的蛋白以SDS-PAGE分析,在Mr约46 000处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22.1%. 结论: 成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物,为获得分子量小而具有相似活性的蛋白奠定了基础.
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人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达
目的 应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白.方法 从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果 构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白.结论 在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础.
