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热激蛋白70B'启动子调控的热诱导型载体pHSP-shTERT的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效应
目的:构建靶向端粒酶逆转录酶(telomerose reverse transcriptas,TERT)的热激蛋白(heat shock protein,HSP)70B'启动子调控的热诱导型RNAi表达载体,观察热诱导条件下其在人乳腺癌MCF-7细胞内的RNAi效应及其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响.方法:PCR扩增HSP70B'启动子序列,用其构建热诱导型靶向TERT的重组载体并转染MCF-7细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达,优化转染和热诱导条件;以未经热诱导的转染细胞为对照组,RT-PCR和Western blotting检测重组载体转染与热诱导对MCF-7细胞内GFP与TERT的mRNA和蛋白表达的影响;MTT实验和流式细胞术分别检测对MCF-7细胞增殖与凋亡的影响.结果:成功构建热诱导型重组载体pHSP-GFP、pHSP-shGFP和pHSP-shTERT;在适热诱导条件(42℃、40 min)下,共转染质粒pHSP-shGFP和pCMV-GFP的MCF-7细胞中GFP表达量显著低于对照组(t=-48.35,P=0.000 43).pHSP-shTERT转染组MCF-7细胞内TERT mRNA[(12.24±1.96)％vs (80.18±2.28)％;t=-286.5,P=0.000 012]和蛋白[(1.64±0.42)％vs(63.45±3.12)％;t=-31.37,P=0.001]的表达均显著下调,细胞存活率显著下降[(58.93±2.95)％vs(91.22±4.16)％;t=15.747,P=0.004],细胞凋亡率显著提高[(40.97±4.80)％ vs(8.33±1.14)％;t=-11.672,P=0.007].结论:靶向TERT的pHSP-shTERT载体可以在热诱导条件下实现MCF-7细胞内靶基因的沉默,从而抑制MCF-7细胞的生长、诱导该细胞的凋亡.
