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HCV C 蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究
目的探讨HCV C蛋白在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)调控作用.方法利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939 HCV C+),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCV C蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性.RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及p50、p65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响.结果①EMSA结果显示QBC939HCV C+细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高.②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCV C蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C+细胞中活化NF-κB为12.8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2.6倍.③RT-PCR显示IκBα mRNA在QBC939 HCV C+细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCV C蛋白的QBC939 HCV C+细胞株的胞核中的p50、p65蛋白高水平表达,而未转染HCV C蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的p50、p65蛋白.在QBC939HCV C+细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达,QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反.结论HCV C蛋白通过增加IκBα降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用.
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NF-κB p50蛋白的原核表达及纯化
目的:提供p50研究所需大量纯蛋白.方法:将编码p50 N端39-376aa肽段的cDNA片段插入到pET-32a (+)载体的BamH Ⅰ和Nco Ⅰ酶切位点之间,构建了p50蛋白原核表达载体(pET-p50),用IPTG诱导表达,His-Bind柱进行纯化.结果:原核表达载体(pET-p50)30 ℃,0.1 mmol/LIPTG诱导5 h,重组蛋白大量表达,经凝胶迁移滞后实验证明纯化的重组p50蛋白具有序列特异性DNA结合活性.结论:在优化条件下,通过His-Bind柱亲和层析法可以获得大量重组蛋白,并通过凝胶迁移滞后实验证明其具有较高的活性.
