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BCR/ABL重组质粒实时荧光定量PCR标准品的制备
目的:用T-A克隆法构建含BCR/ABL融合基因的重组质粒,并用实时定量PCR(RQ-PCR)方法制备标准品.方法:通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳胶回收纯化,T-A克隆与pUCm-T载体连接,转染DHSa菌,蓝白斑筛选阳性菌落后,大量提取质粒,再进行RQ-PCR,后制得BCR/ABL的重组质粒标准品.结果:蓝白斑筛选实验、PCR扩增均证实BCR/ABL融合基因重组到pUCm-T载体上,经RQ-PCR定量后得到BCR/ABL重组质粒标准品的标准曲线.结论:该方法能大量制备质粒标准品,并且可被推广应用.
关键词： Bcr/abl融合基因 pUCm-T载体 T-A克隆法 实时定量PCR -
人成熟型TGF-β1基因T克隆载体的构建
目的构建人成熟型TGF-β1基因T克隆载体,为进一步研究人成熟型TGF-β1的原核表达和功能打下基础.方法应用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞扩增人成熟型TGF-β1编码区cDNA基因(336 bp),并将其克隆至pUCM-T载体,经限制性核酸内切酶EcoR I, Hind III的酶谱分析和DNA测序分析证实.结果成功构建人TGF-β1/T载体,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究.结论人TGF-β1/T载体的构建,为进一步研究其基因表达和功能打下基础,对肝纤维化的防治具有较大意义.
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蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析
目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.
