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欧文氏菌发酵生产紫杉醇工艺的优化
考察了植物内生细菌欧文氏菌(Erwinia taxi)生产紫杉醇的摇瓶发酵和30 L罐发酵工艺条件.结果显示,培养基中添加不同的前体对紫杉醇产量影响显著.较高浓度的乙酸钠(＞0.01 mmol/L)和较低浓度的苯丙氨酸 (＜0.05 mmol/L)有利于紫杉醇积累.在此基础上进行了30 L罐发酵试验,得优化培养基配方(g/L):大豆蛋白胨20,工业酵母抽提物5,氯化钠0.5,氯化钾0.1,葡萄糖4,氯化镁1,乙酸钠0.1,苯丙氨酸5×10-4; pH 6.5.发酵培养条件:接种量5％,发酵温度22℃,通气速率0.17 vvm,转速50 r/min,发酵时间60h.在此条件下,30L发酵罐中紫杉醇的产量为102 μg/L.
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欧文氏菌SCB125中2-酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
根据酶活测定和PAGE活性染色初步证明欧文氏菌SCB125中存在酶活较高的2-酮醛糖酸还原酶(2-KR)，能够以2，5-二酮-D-葡萄糖酸(1)、2-酮-L-古洛糖酸(2)或者2-酮-D-葡萄糖酸(3)为底物。抽提欧文氏菌染色体DNA为模板，利用PCR技术扩增，克隆得到两个2-KR酶基因(tkrA和tkrB)，通过酶切和测序证明：2-KR A基因发生多处突变，而2-KR B基因保守。将含有这两个基因的片段分别连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后，均获得高酶活表达。如果进一步用基因剔除的方法破坏欧文氏菌染色体上野生型2-KR基因，可以获得一个表达1还原酶的理想宿主，为实现从葡萄糖一步发酵生产维生素C前体2打下基础。
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Real-time PCR法检测注射用门冬酰胺酶制剂中大肠杆菌核苷酸残留
目的:建立可定量检测注射用门冬酰胺酶制剂中大肠杆菌核苷酸残留量的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于注射用门冬酰胺酶制剂中大肠杆菌核苷酸残留的质量控制.方法:选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶基因设计扩增引物,以ABI 7500 FAST平台为基础,建立基于SYBR Green荧光染料的Real-time PCR检测方法.结果:该法检测大肠杆菌核苷酸质量浓度在0.009 35～93 500 ng·mL-1范围内线性良好,标准曲线的相关系数为0.999,定量限为0.009 35 ng· mL-1.应用该法对2批注射用门冬酰胺酶制剂进行测定,均未检出大肠杆菌核苷酸残留.结论:该方法可用于注射用门冬酰胺酶制剂中大肠杆菌核苷酸残留的定量测定.
