221名汉族人胰岛素受体底物-2基因G1057D多态性的研究

胰岛素受体底物(IRS)主要连接胰岛素受体和多种效应分子,介导细胞对胰岛素(INS)等的反应.基因剔除研究显示,IRS-1纯合突变(IRS-1-1-)鼠仅出现胰岛素抵抗(IR),而IRS-2-1-鼠具有2型糖尿病(T2DM)的全部特征.本研究用PCR-RFLP方法检测辽宁地区中年汉族人群IRS-2G1057D多态性,并结合T2DM发病机制相关的INS分泌和作用的简易指标的变化,明确IRS-2 G1057D多态性与T2DM的相关性.

双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用

随着人类基因组计划完成日期的不断提前, 基因组全序列的测定也已经接近尾声.在基因组时代, 许多DNA序列信息让我们对其相关基因组的结构和功能有了一定的了解.然而DNA序列信息不是万能的,它不能预测[1]: 1)基因表达产物是否或何时被翻译; 2)基因产物的相应含量;3)翻译后修饰的程度;4)基因剔除或过表达的影响; 5)多基因现象的表型.

转化生长因子β2在小鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的作用

目的利用Cx43基因剔除(KO)小鼠模型,观察TGFβ2在心脏流出道隔的表达,探讨Cx43基因剔除小鼠心脏流出道隔心肌化异常与TGFβ2的关系;采用胚心脏体外培养技术,研究外源性TGFβ2是否促进流出道隔心肌化过程.方法选用胚E12.5～E15.5 d的Cx43基因剔除纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)及野生型(Cx43+/+)C57/BL6小鼠作为研究对象,采用PCR方法鉴定基因型,免疫组织化学法测定TGFβ2;选用野生型E12.5进行胚心脏体外培养至E15.5,同时加用TGβ2不同剂量干预处理,免疫组织化学法测定肌节肌动蛋白α-SCA的表达.结果 Cx43 KO小鼠胚期心脏近端流出道隔心肌细胞明显减少,尤其以E13.5和E14.5的Cx43-/-小鼠为著.与Cx43+/+小鼠对照,Cx43-/-小鼠心脏近端流出道隔TGFβ2的表达明显降低,以E14.5较为显著;E14.5的Cx43+/-小鼠表达也有降低.然而TGFβ2不同剂量干预组均没有见到明显的促进离体心脏心肌化的作用.结论 Cx43 KO小鼠心脏近端流出道隔存在明显的心肌化延迟.TGFβ2表达减少可能参与了Cx43-/-小鼠心肌化异常的发病机制.体外应用TGFβ2可能难以模拟在体的时空表达模式,或者心肌化的进行需要精确的TGFβ2的剂量和严格的培养条件.

应用PCR-SBT方法检测CD36相关基因变异的研究

CD36为一种血小板上的特异性抗原，又称glycoprotein Ⅳ(GPⅣ)，是血小板反应(thrombospondin)受体[1]。CD36基因变异会导致CD36抗原的缺失，此类人群若有输血、怀孕、造血干细胞移植等免疫因素就可能产生anti-CD36抗体[2-3]，导致血小板输注无效，输血后紫斑，各种免疫性血小板减少等临床症状；另外也有研究指出CD36基因变异与高血脂症、感染疟疾及胰岛素耐受性有关联[4]；近来在CD36基因剔除的小鼠中研究发现，血小板可经由CD36接受微颗粒(microparticles)的刺激而活化，CD36缺乏血小板被微颗粒活化的能力会降低，因而使止血时间延长[5]。

2型糖尿病患者胰岛素受体底物-2基因G1057D突变频率及意义

胰岛素抵抗(IR)的分子机制,特别是分子靶点及细胞内信号转导机制的研究,成为近年2型糖尿病(T2DM)的研究热点,其中胰岛素受体底物(IRS)备受关注.基因剔除研究显示[1,2],IRS-1纯合突变(IRS-1-/-)鼠仅出现轻度的IR,不发展为糖尿病.IRS-2-/-鼠则出现中、重度IR及T2DM的全部特征,提示IRS-2基因突变可能参与T2DM的发生.人类IRS-2基因定位于13q8.6,IRS-2基因G1057D系编码区的单核苷酸多态性(SNP)使氨基酸序列1057位发生了G→D替代,但该多态性位点的功能学意义,国外报道结果不尽一致.由于基因变异存在种族及地区性差异,故本研究以其为遗传标记,运用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法,对辽宁省汉族人群该突变进行检测,同时结合生化及放免指标的变化,明确该突变与T2DM的相关性.

Claudin 家族基因剔除小鼠表型的研究进展

密封蛋白（ Claudin）是细胞间紧密连接的骨架蛋白，参与维持紧密连接的各种功能，其异常表达可破坏上皮细胞及内皮细胞的结构，导致其功能严重受损。近年来，关于 Claudin基因不同生理作用的研究越来越受到人们的关注，基因剔除技术将在整体动物水平研究基因功能成为可能。该文就Claudin家族基因剔除后的小鼠表型进行综述，旨在了解Claudin基因的生理功能。

Bcl-2基因家族在中枢神经系统中的作用

Bcl-2家族在中枢神经系统发育和动态平衡中起重要的作用.在调节神经元分化方面Bcl-xl和Bax起决定性作用,而Bax和Bak在调节神经祖细胞量方面起作用.Bax、Bcl-xl和Bcl-2调节神经营养因子剥夺所引起的细胞凋亡.相反,细胞兴奋性中毒死亡不依赖于Bax或Bak,但Bak缺乏能增强神经兴奋因子的毒性.

血管紧张素转换酶2在SARS-CoV感染中的功能(第1部分)--血管紧张素转换酶2基因剔除小鼠的建立

目的血管紧张素转换酶是肾素-血管紧张素系统的重要组成部分.血管紧张素转换酶主要功能是通过把血管紧张素Ⅰ转换成血管紧张素Ⅱ来调节血压,新的研究显示它也是SARS冠状病毒的一种受体.建立血管紧张素转换酶2基因剔除小鼠,为进一步的SARS机理研究提供工具.方法通过将D3小鼠胚胎干细胞DNA进行同源重组,用反向表达的新霉素基因替代ACE2基因-2000bp至+489 bp的DNA片段,并用Western blot检测纯合体小鼠ACE2基因的表达.结果血管紧张素转换酶2基因剔除小鼠ACE2基因的表达被完全阻遏.结论建立了ACE2基因剔除小鼠.

雄性Fmr1基因敲除小鼠血液生理生化指标及性激素水平的比较研究

目的 比较雄性Fmr1基因敲除小鼠和FVB小鼠血液生理生化值和血清性激素水平,探讨Fmr1基因对动物生长发育和生殖生理等方面的影响.方法 分别测定血液生理指标、血清生化指标、血清电解质和血清E2、LH、FSH、T和PRL的含量,并进行统计学处理和分析.结果 雄性Fmr1基因敲除小鼠与FVB小鼠比较,血液生理指标中MCV和PCT有显著差异(P ＜ 0.05),而RBC、HCT、HGB、MCH和WBC等无显著差异(P ＞ 0.05);血清生化指标中除TBIL、[IP3+]、[Mg2+](P ＜ 0.05)和ALP、BUN(P ＜ 0.01)外,TPROT、GLB、A/G、BUN、CREAT、[K+]、[Na+]等项均无显著差异(P ＞ 0.05).性激素水平E2、LH值差异无显著性(P ＞ 0.05),FSH、T、PRL差异极显著(P ＜ 0.01).结论 Fmr1基因可影响动物的某些生理生化及激素水平.

5-脂氧化酶抑制或基因剔除减轻内毒素血症引起的多器官功能障碍

半胱氨酸蛋白酶与视黄酸诱导肿瘤细胞凋亡

半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成员是近年来发现的在细胞凋亡过程中发挥中心作用的一类蛋白水解酶.它们以酶原的形式存在,一旦被凋亡信号激活,就能通过从天冬氨酸残基处特异地水解关键蛋白引起细胞凋亡.大量研究证实,caspase是凋亡所必需的介导者.由于凋亡的失调可促进人类疾病的发生,这些发现具有重大意义.一方面,caspase的失活引起凋亡不足可促进癌症的发生,近,对caspase基因剔除动物的研究为这一问题提供了更肯定的回答.另一方面,caspase过度激活或反复激活可促进细胞自杀.这可能是退行性疾病如Hungtington、Alzheimer的基础.caspase信号通路的阐明可为肿瘤的治疗和一些退行性疾病的预防提供理论依据.

剔除小鼠神经微管运动蛋白Kif1b基因产生轴索型神经退行性病变

目的 研究杂合子小鼠Kif1b基因剔除后神经系统的病理改变,为Charcot-Marie-Tooth(CMT)病动物模型的分型提供病理学依据.方法用PCR和Southern blotting检测基因型和验证同源重组,通过脊髓前角细胞HE染色和坐骨神经甲苯胺蓝染色及电镜标本制备观察病理改变.结果 Kif1b基因组DNA用Southern blotting检测表明,PCR法挑选的19只小鼠全部发生了同源重组.杂合子Kif1b基因剔除小鼠的坐骨神经内,粗径有髓纤维轴索变性,数量减少.在光镜和电镜下可见轴索的限局性肿胀,肿胀处可见壅堵的细胞器,但未见髓鞘的改变、节段性脱髓鞘和"洋葱球"样改变;其脊髓前角细胞体中,HE染色可以看到典型的嗜酸性球状体变性,电镜下显示为各种细胞器堵塞在核周和在细胞通往轴索的出口处,包括排列紊乱的神经丝、线粒体、空泡及多室小体.脊髓前角细胞数目明显减少.结论杂合子Kif1b基因剔除小鼠的病理改变与人类CMT2A具有相似性.

脂联素基因剔除小鼠糖代谢和骨代谢的初步研究

目的:研究前期建立的脂联素基因剔除小鼠模型在基础状态的葡萄糖代谢及骨代谢状态.方法:采用长期追踪野生型和该基因剔除纯合子小鼠的体重和空腹血糖水平,并进行葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐量(ITT)试验以评价该小鼠的葡萄糖代谢能力.对骨代谢的初步研究采用检测小鼠骨密度(BMD)的方式.结果:发现该基因剔除小鼠在6w时,出现空腹血糖比对照组显著低下的现象,而随着鼠龄的增长,血糖水平又趋于正常.GTT和ITT试验证明该基因别除小鼠无糖尿病或胰岛素抵抗表型.BMD检测亦显示该小鼠在基础状态下无骨密度低下的现象.结论:脂联素基因剔除小鼠在基础状态下并无显著的糖代谢和骨代谢异常.

糖代谢相关蛋白1对小鼠糖代谢的调控作用

目的 探讨糖代谢相关蛋白1(glucose metabolism-related protein 1, GMRP1)对c-Myc基因转录的调控作用,建立基因剔除小鼠模型并研究GMRP1基因缺失对小鼠糖代谢的影响.方法 采用染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR筛选GMRP1转录调控的基因,荧光素酶报告基因系统检测GMRP1对c-Myc基因启动子活性的调节.构建GMRP1基因全身剔除小鼠模型,PCR及Western印迹验证小鼠模型是否构建成功.在普通饮食及高脂饮食的喂养条件下,监测基因剔除小鼠及野生小鼠的体重及随机血糖.采用经腹腔注射的葡萄糖耐量试验评估小鼠20周龄及28周龄时的糖代谢水平.结果 GMRP1与c-Myc基因的启动子结合,并能激活c-Myc基因的转录.GMRP1基因剔除小鼠与野生C57小鼠比较,无论在普通饮食还是高脂饮食的喂养条件下,体重及随机血糖均无显著差异,糖耐量也无显著性差异(均P>0.05).结论 GMRP1能激活 c-Myc基因的转录,GMRP1基因缺失对小鼠的糖代谢无显著改变.

欧文氏菌SCB125中2-酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据酶活测定和PAGE活性染色初步证明欧文氏菌SCB125中存在酶活较高的2-酮醛糖酸还原酶(2-KR)，能够以2，5-二酮-D-葡萄糖酸(1)、2-酮-L-古洛糖酸(2)或者2-酮-D-葡萄糖酸(3)为底物。抽提欧文氏菌染色体DNA为模板，利用PCR技术扩增，克隆得到两个2-KR酶基因(tkrA和tkrB)，通过酶切和测序证明：2-KR A基因发生多处突变，而2-KR B基因保守。将含有这两个基因的片段分别连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后，均获得高酶活表达。如果进一步用基因剔除的方法破坏欧文氏菌染色体上野生型2-KR基因，可以获得一个表达1还原酶的理想宿主，为实现从葡萄糖一步发酵生产维生素C前体2打下基础。

Trp53基因剔除小鼠的制备及其在药物致癌性评价中的应用

目的 建立Trp53基因剔除小鼠模型.方法 本研究拟通过基因工程技术建立Trp53基因剔除小鼠模型,通过RT-PCR、Western-blot等技术检测野生型、杂合子、纯合子小鼠中Ttp53基因的表达;观察三种基因型小鼠自发肿瘤情况并进行病理分析;以N-甲基亚硝基脲(MNU)为致癌剂,探索该模型用于药物致癌性评价的可行性.结果 DNA、RNA及蛋白水平的研究证实,已成功获得Trp53基因剔除小鼠模型.初步的表型分析显示:Trp53基因纯合缺失小鼠自出生13周起陆续发生肿瘤,至36周时所有观察纯合小鼠均死于肿瘤,以恶性胸腺淋巴瘤为主(60％).与野生型小鼠相比,基因杂合缺失小鼠对致癌剂的敏感性显著提升,杂合小鼠经75 mg/kg体重的N-甲基亚硝基脲(MNU)诱导,90％的小鼠发生肿瘤,其中86％为恶性胸腺淋巴瘤,而野生小鼠经药物诱导后只有60％发生肿瘤.腹腔注射枸橼酸缓冲液的80只对照组小鼠均未观察到肿瘤的发生.结论 这一模型的建立为Trp53基因功能研究和药物致癌性评价提供了理想的动物模型.

热休克因子1基因剔除小鼠的遗传特征及基因型分析

为观察热休克因子1基金剔除小鼠的遗传特征和基因型,摸索获得较多纯合子的繁殖技术, 建立3组繁殖组合方式:①野生型♂×野生型♀组;②杂合子♂×杂合子♀组;③纯合子♂×杂合子♀组,并比较各组子代的基因型.结果表明, 杂合子♂×杂合子♀组和纯合子♂×杂合子♀组,获得纯合子子代分别为10.8%和22.0%.纯合子♂×杂合子♀组每胎产仔数(4.3只/胎)较野生型♂×野生型♀组(6.5只/胎)及杂合子♂×杂合子♀组(6.4只/胎)少 . 通过HSF1剔除鼠的不同繁殖方法的比较及遗传特性观察,揭示了获得较多纯合子HSF1剔除小鼠的繁殖技术.

小鼠GCPⅡ基因剔除对脑外伤后脑水肿的影响

目的 研究普通小鼠和GCPⅡ基因剔除后小鼠脑外伤后脑水肿的变化,探讨并研究GCPⅡ基因剔除后对脑外伤后脑水肿的影响.方法 雄性C57BL/6J小鼠随机20只,随机分为两组(C57BL/6J小鼠假手术组10只,C57BL/6J小鼠颅脑损伤组10只).雄性GCPⅡ基因剔除小鼠随机20只,随机分为两组(GCPⅡ基因剔除小鼠假手术组10只,GCPⅡ基因剔除小鼠颅脑损伤组10只),应用PinPointTMPCI3000精细颅脑撞击仪,设定参数(打击深度为1.5mm;打击时间为80ms,打击的速度为1.5m/s),精确撞击小鼠脑皮质.伤后24h,行干湿重法测脑组织含水量,Western Blot检测AQP4蛋白的表达,MRI检测水肿程度,伊文思蓝检测血脑屏障破坏程度.结果 GCPⅡ基因剔除小鼠较C57BL/6J小鼠外伤后神经功能明显改善(P＜0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠脑组织含水量、水肿体积以及外伤区域T2 WI信号强度较C57BL/6J小鼠降低(P＜0.05).结论 小鼠的GCPⅡ基因剔除后脑外伤后脑水肿较C57BL/6J小鼠明显减轻,进一步证明小鼠GCPⅡ基因敲除后对脑外伤后脑组织的保护作用.

小鼠GCPⅡ基因剔除对脑外伤后神经元的影响

目的 研究谷氨酸羧肽酶Ⅱ(GCPⅡ)基因剔除小鼠和野生型C57BL/6J小鼠脑外伤后损伤周围区神经元的凋亡以及神经功能变化.方法 雄性C57BL/6J小鼠随机20只,雄性GCPⅡ基因剔除小鼠随机20只,随机分为4组(C57BL/6J小鼠假手术组10只,GCPⅡ基因剔除小鼠假手术组10只,C57BL/6J小鼠颅脑损伤组10只,GCPⅡ基因剔除小鼠颅脑损伤组10只),应用PinPointlTM PCI3000精细颅脑撞击仪,设定参数(打击深度为1.5mm,打击时间为80 ms,打击的速度为1.5m/s),精确撞击小鼠脑皮质.伤后24h行神经功能评分,免疫荧光染色,损伤周围区凋亡神经元计数.结果 GCPⅡ基因剔除小鼠较C57BL/6J小鼠外伤后神经功能明显改善(P＜0.05);损伤周围区神经元凋亡数值较C57BL/6J小鼠组明显降低(P＜0.05).结论 小鼠GCPⅡ基因剔除后,脑外伤后损伤周围区神经元凋亡数较C57BL/6J小鼠明显减少,神经功能明显改善,进一步证明小鼠GCPⅡ基因敲除后对脑外伤后脑组织的保护作用.

宿主抗感染相关基因研究进展

宿主对病原体的易感性是受遗传基因控制的.近年来,各国学者通过抗性动物品系的筛选、近交系动物杂交分析、遗传系谱分析、标志基因连锁分析、等位基因分析、基因突变分析、转基因小鼠模型和基因剔除小鼠模型等方法和技术,对宿主的,特别是小鼠和人的抗感染相关基因进行了研究和分析,这为深入研究宿主的抗感染免疫机制奠定了基础.现就这方面的主要进展作一综述.