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脐血间充质干细胞肌源性诱导分化的研究
目的研究脐血间充质干细胞(MSC)体外的采集、培养和扩增,探讨MSC肌源性分化的条件和能力.方法选择杂种妊娠犬11只,采集适量脐带血,常规分离后获得单核细胞,分别接种于不同的培养液中进行培养和体外传代扩增.免疫组织化学检测脐血MSC表面抗原的表达;5-氮杂胞嘧啶核苷(5-aza)诱导处理脐血MSC,观察细胞形态结构的变化及肌源性标记物的表达.结果犬脐血MSC在IMDM中生长良好,增殖迅速,每传一代细胞扩增2 ～ 3倍,传至7代后细胞可扩增1.5×102 ～ 2.0×103倍;脐血中包含破骨细胞样和纤维母细胞样贴壁细胞,后者CD29和CD71表达阳性,CD11a、CD11b和CD34表达阴性;脐血MSC在10 μmol/L的5-aza诱导3周后体积延长,与邻近细胞形成连接,并表达肌节性肌动蛋白和结蛋白,与阳性对照结果相似.结论脐血MSC是存在于脐血中的一类不同于造血干细胞的原始细胞,在体外可大量扩增,在诱导剂的作用下向肌源性定向分化.
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5-氮杂胞嘧啶核苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞凋亡
目的 研究5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响.方法 从小鼠股骨和胫骨骨髓中分离BMSCs;利用免疫荧光染色检测间充质干细胞特异性标记分子CD44和CD90在BMSCs上的表达;应用0、10和20 μmol/L的5-AZA体外诱导培养BMSCs 48 h,应用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)凋亡试剂盒检测5-AZA处理后细胞的凋亡率;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Annexin V和Caspase-3在处理后的细胞表达水平.结果 实验中,BMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记蛋白CD44和CD90.DAPI染色和Caspase-3染色均显示10和20 μmol/L 5-AZA可增加BMSC的凋亡率;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20 μmol/L 5-AZA组DAPI染色阳性凋亡率分别为(21.086±2.601)％、(34.467 ±3.724)％和(46.512±3.864)％,Caspase-3染色阳性凋亡率分别为(5.354±0.735)％、(15.462±2.385)％和(28.190 ±4.190)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).Westernblot检测显示Annexin V和Caspase-3在5-AZA处理后表达均显著增高;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20μmol/L 5-AZA组Annexin V相对表达水平分别为(26.612±2.184)％、(42.873 ±4.313)％和(50.056±4.457)％,Caspase-3的相对表达水平分别为(19.231 ±2.683)％、(38.618 ±5.385)％和(91.235 ±7.116)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论 常规剂量的5-AZA可诱导BMSCs凋亡.
关键词： 5-氮杂胞嘧啶核苷 骨髓间充质干细胞 细胞凋亡 Caspase-3表达 -
5-氮杂胞嘧啶核苷联合hepaCAM腺病毒通过抑制p-AKT诱导膀胱癌细胞T24凋亡
目的:研究5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine,azac)联合肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)腺病毒对膀胱癌细胞T24凋亡的影响及可能机制的探讨.方法:7种不同因素分别处理培养的膀胱癌细胞T24,hoechst 33258染色检测各处理组细胞凋亡率,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞早期凋亡率,RT-PCR检测hepaCAM及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,bcl-2) mRNA的表达,Western blot检测hepaCAM、p-AKT、total-AKT、bcl-2蛋白的表达.结果:hoechst 33258显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞凋亡率为(45.21±0.06)％,明显高于hepaCAM腺病毒组(15.60±0.02)％和azac组(26.30±0.02)％,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.008);FCM显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞早期凋亡率为(16.05±0.06)％,明显高于hepaCAM腺病毒组(3.90±0.02)％和azac组(9.67±0.02)％,差异有统计学意义(P=0.002,P=0.043);RT-PCR显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac与hepaCAM腺病毒联用可以上调hepaCAM mRNA的表达(P=0.004,P=0.000),下调bcl-2 mRNA的表达,差异有统计学意义(P=0.026,P=0.030);Western blot显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac联合hepaCAM腺病毒组可上调hepaCAM蛋白的表达(P=0.003,P=0.003),同时下调p-AKT(P=0.001,P=0.005)和bcl-2(P=-0.000,P=0.002)蛋白的表达,差异有统计学意义.结论:azac联合hepaCAM腺病毒可能通过抑制p-AKT的磷酸化水平加速诱导T24细胞凋亡,可为膀胱癌的治疗提供新的思路.
