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β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达
目的构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,为进一步研究β-catenin在神经细胞内与其它蛋白质如tau、PS1的相互作用以及在阿尔茨海默病发病机制中的作用提供一种有用的工具.方法用亚克隆的方法将β-连环素基因插入到真核表达载体pEGFP-C1,重组质粒pEGFP-cat瞬时转染野生型鼠成神经瘤细胞株,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率.结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin的重组质粒构建成功,免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin-GFP融合蛋白在真核细胞中获得表达.结论成功构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在鼠成神经瘤细胞中表达了β-catenin-GFP融合蛋白.
关键词： β-catenin基因 绿色荧光蛋白 成神经瘤细胞 融合蛋白 -
DVL-1 cDNA重组质粒在N2a细胞中的瞬时表达
目的将鼠dishevelled-1(DVL-1)cDNA重组质粒转染到培养的鼠成神经瘤细胞N2a,建立瞬时表达系统,为研究Wnt信号途径在阿尔茨海默病(AD)发病中的作用提供实验基础.方法用常规分子生物学方法扩增、纯化DVL-1 cDNA重组质粒,用紫外分光技术检测纯化质粒的纯度;用脂质体介导法将重组质粒转染入培养的鼠成神经瘤细胞N2a,用免疫印迹、免疫荧光法从蛋白质水平检测转染和表达效果.结果质粒酶切电泳结果显示:鼠DVL-1 cDNA重组质粒PCS2+MT-MDVL1扩增和纯化成功,纯度达到要求;免疫印迹、免疫荧光结果显示外源鼠DVL-1 cDNA重组质粒在鼠成神经瘤细胞N2a中获得表达,基因转染和表达率为57.6%.结论成功将鼠DVL-1 cDNA重组质粒转染到培养的鼠成神经瘤细胞N2a中,并获得瞬时表达.
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Alzheimer样蛋白磷酸酯酶缺陷的细胞毒性作用及其保护途径的探讨
目的和方法:蛋白磷酸酯酶缺陷是Alzheimer病(AD)患者神经细胞骨架蛋白异常磷酸化及其所致的神经原纤维变性的基础.本研究在细胞水平探讨AD样蛋白磷酸酯酶缺陷对神经细胞的毒性及其保护途径.结果:(1)15 nmol/L冈田酸(okadaic acid, OA)可使人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)光泽度降低,突起数目减少,轴突长度缩短,细胞活性降低;当增加OA浓度至30 nmol/L时,上述细胞毒性作用增强,并出现大量无光泽,无突起的圆形细胞;当OA浓度达45 nmol/L时,全部细胞均漂浮死亡.(2)正常SY5Y细胞中神经细丝以非磷酸化和磷酸化两种形式分布在细胞的胞体和突起,用OA处理后,识别磷酸化神经细丝的抗体SMI31和SMI34显色随OA浓度增加而明显增强,尤其在胞体中增强作用更为显著.相反,识别非磷酸化神经细丝的抗体SMI32和SMI33显色随OA浓度增加而显著减弱.(3)OA处理使抗微管蛋白的抗体DM1A显色显著减弱.(4)免疫印迹定量分析结果表明:OA处理使神经细丝和微管含量呈剂量依赖性降低.(5)一定浓度的褪黑激素(Melatonin, Mel)可从细胞形态,细胞活性,细胞骨架蛋白的磷酸化及细胞骨架降解等不同水平拮抗OA的毒性作用.结论:该研究结果为AD发病机制、模型复制以及有效防治途径提供了新资料.
