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重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定
利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶( L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化人BL21( DE3).乳糖诱导使其表达,其中80％以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质.将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95％以上.利用酶联免疫吸附试验( ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性.
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蛋白A的固定及在抗体亲和纯化中的应用
目的 以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose 4FF后纯化兔免疫蛋白IgG.方法 以环氧氯丙烷(ECH)活化凝胶,正交试验确定佳活化条件;以纯化数据确定抗体兔免疫蛋白IgG纯化佳缓冲液盐浓度.结果 Sepharose 4FF佳活化条件:ECH浓度20％(v/v),0.8 mol/L NaOH添加量为1 mL/1 g Sepharose 4FF湿胶,活化时间2.5 h,反应温度40℃.结论 建立将活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF与蛋白A偶联的条件,可应用于纯化兔免疫蛋白IgG.
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ATM、Chk2、p53和Rad51的表达与乳腺癌的相关性研究进展
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,它的发生和发展是多个基因参与的复杂过程.共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)和细胞周期检测点激酶2 (Chk2)是重要的细胞周期检测点激酶,p53是重要的抑癌基因,重组蛋白A (Rad51)是DNA同源重组修复的主要关键酶之一.本文就乳腺癌与ATM、Chk2、p53及Rad51的相关性及意义做一简要综述.
关键词： 乳腺癌 共济失调-毛细血管扩张突变基因 点激酶2 P53 重组蛋白A -
参芎化瘀胶囊对全脑缺血大鼠海马CA1区RHOA和ROCK-Ⅱ表达的影响
目的 探讨参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血大鼠海马CA1区重组蛋白A(small GTP bindingprotein A,RHOA)和RHO激酶2(RHO associated protein kinase-2,ROCK-Ⅱ)表达的影响.方法 96只SD雄性大鼠分3组,每组32只,造模前7d开始灌胃,至处死日早晨结束.正常对照组(生理盐水灌胃)、全脑缺血模型组(生理盐水灌胃)和参芎化瘀胶囊+全脑缺血组(参芎化瘀胶囊0.048 g/kg体质量,溶于0.5 mL双蒸水中,每日1次,灌胃0.3 mL/100 g体质量).后两组采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型,分别在造模成功后1、3、7、14d四个时间点采用水迷宫行为学检测评价学习记忆能力,处死大鼠后取脑组织HE染色观察组织病理学的变化,免疫组化法观察RHOA和ROCK-Ⅱ表达,蛋白印迹分析检测RHOA和ROCK-Ⅱ蛋白含量.结果 和正常对照组比较,模型组大鼠各个时间点逃避潜伏期时间延长(P＜0.05),参芎化瘀胶囊治疗后大鼠逃避潜伏期时间缩短(P＜0.05),但仍长于正常对照组(P＜0.05).HE染色显示,与正常组比较,模型组大鼠海马CA1区神经元1～14 d存活神经元逐渐减少;参芎化瘀胶囊治疗后各个时间点存活神经元增加(P＜0.05),但仍少于正常组(P＜0.05);免疫组化和蛋白印迹分析显示,正常对照组RHOA和ROCK-Ⅱ表达不明显,模型组先升高后下降.参芎化瘀胶囊组所有时间RHOA和ROCK-Ⅱ表达均较模型组降低(P＜0.05),但仍高于正常组(P＜0.05).结论 参芎化瘀胶囊改善全脑缺血引起的神经元损伤,降低海马CA1区RHOA和ROCK-Ⅱ的表达.
