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人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立
目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs) OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础.方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构.其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA (single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞.后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型.结果:生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88％,且具有相似的功能结构域.成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型.结论:人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性.构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料.
关键词： OSBPL2 共线性分析 CRISPR/Cas9 PFFs -
基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株.方法:设计3个单导向RNA(singleguide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2、3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体.分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率.选出靶向效率高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,后用Western blot鉴定敲除效果.结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达.结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功.
关键词： CRISPR/Cas9 OSBPL2 HeLa细胞株 单克隆细胞
