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Six1/Six4基因敲除细胞系文献资料
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CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立
目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型.本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础.方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA (single guide RNA,sgRNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sgRNA1和PX330-sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(pCMV-tdTomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定.结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体.转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个.通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个.结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能.
