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RecA激活的抗辐射菌LexA蛋白降解及其在碱性条件下的诱导降解
目的研究在碱性条件下LexA蛋白的降解,观察D.radiodurans(抗辐射菌)LexA在两种条件下的降解反应.方法采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,用考马斯亮蓝R-250染色.结果 37℃时,LexA蛋白在pH 7.0及pH 8.0时不发生分解反应;pH 9.0时完整的LexA蛋白量略有减少;pH 10.0时,LexA蛋白大量分解,电泳带可见明显的蛋白片段.结论高pH值条件下D.radiodurans LexA蛋白在37℃发生降解.其对碱性pH条件的依赖提示了降解的激活需LexA蛋白离子化基因的去氢离子反应.
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铜绿假单胞菌LexA蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
目的克隆铜绿假单胞菌PAO1株的LexA蛋白编码区,在大肠杆菌中表达并纯化表达蛋白.方法提取铜绿假单胞菌PAO1株基因组DNA,PCR扩增LexA蛋白编码区,A-T克隆于质粒pMD 18-T载体中,阳性重组子经酶切后,回收目的片段连接至相应线性化的表达型载体pET-28a(+)中,重组质粒经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21感受态,筛选高效表达株,表达产物经SDS-PAGE初步鉴定后,用镍珠吸附一步法纯化,表达蛋白转印PVDF膜后,经N-端测序证实.结果本研究成功克隆到PAO1株的LexA蛋白编码区并在大肠杆菌中获得表达,纯化表达蛋白经N-端测序证实确为PAO1的LexA蛋白.结论研究结果为铜绿假单胞菌PAO1株基因组中SOS盒的实验鉴定及LexA蛋白调控基因的筛选奠定了基础.
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铜绿假单胞菌PAO1株基因组中2个SOS盒序列的初步鉴定
目的 鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1株基因组中的SOS盒序列.方法 挑选铜绿假单胞菌PAO1株基因组中16个可能含有SOS盒序列的DNA片段,经PCR扩增后,用纯化的LexA表达蛋白做凝胶滞后实验;将获得的2个阳性DNA片段进一步用DNase Ⅰ足纹法进行LexA蛋白结合序列即SOS盒的鉴定;分析所获得的2个SOS盒中的回文序列,以此回文序列在PAO1基因组中进行检索,初步分析出可能的SOS盒序列和可能的调控基因.结果 通过DNase Ⅰ足纹法初步鉴定了PAO1基因组中2个SOS盒序列,即位于基因组4 052 647～4 052 662 bp位置的CTGTCTACTFATACAG序列和5 349 888～5 349 903 bp位置的CTGTATAAATAACCAC序列,分析其回文结构为"CTG…CAG",以此回文序列在基因组中进行检索,共获得了10个候选的SOS盒序列.结论 初步证实了PAO1基因组中的2个SOS盒,并获得了10条SOS盒候选序列.
