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人DNase I的表达、纯化及降解NETs活性研究
为获得纯度较高的人脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)以研究其对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的降解作用,构建基因工程表达菌E.coli Rosetta(DE3)/pET32a-His-DNase I,乳糖诱导表达,经镍柱亲和纯化获得融合蛋白His-DNase I.提取小鼠中性粒细胞,用佛波酯PMA刺激形成NETs,SytoxGreen及荧光显微镜检测融合蛋白对NETs的降解活性.结果表明,成功构建人DNase I基因克隆并在原核细胞中实现高效表达,纯化的His-DNase I具备较高的核酸酶活性.本研究为进一步探究DNase I的临床应用奠定了理论基础.
关键词： 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 中性粒细胞胞外诱捕网 分离纯化 His标签 -
树鼩载脂蛋白AV基因的克隆、表达和纯化
目的 构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白.方法 从树鼩肝细胞中提取总RNA,经逆转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因.PCR扩增产物和pET32a原核表达载体经过双酶切,将纯化回收的酶切产物按适当的摩尔比通过T4 DNA连接酶16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10,挑克隆测序.将克隆成功的载脂蛋白AV重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,并优化诱导条件.表达的载脂蛋白AV经镍离子螯合树脂纯化,采用BCA法分析蛋白浓度,纯度测l定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合薄膜凝胶扫描分析获得.结果 挑选的克隆经测序证实载脂蛋白AV基因已经成功连接入pET32a原核表达载体中.在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,有分子量大小约60 kDa的特异性蛋白产生,与预期大小一致.重组蛋白诱导的佳表达时间为5h左右,佳浓度约在20 μmol/L.镍离子螯合树脂柱亲和层析获得的纯化蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后薄膜凝胶扫描分析显示目的蛋白的纯度在95％以上.结论 成功构建了载脂蛋白AV的原核表达载体,该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化后的载脂蛋白AV纯度约95％,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.
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C端带His标签重组ScFv真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建表达抗p185且含His标签的ScFv的真核表达载体.方法:通过PCR自pcDNA-H520C9ScFv-hIL-2质粒中获得H520C9ScFv片段,将此片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中;设计引物在ScFv片段C端增加His标签和凝血酶识别序列,再与质粒pcDNA3.1(+)连接,将所得的融合基因进行限制性内切酶EcoR I、Hind Ⅲ双酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定,并测定目的序列.结果:成功将H520C9ScFv片段、His标签和凝血酶识别序列插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-His-ScFv,为下一步在真核细胞中表达和纯化抗p185单抗奠定基础.
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带His标签重组产朊假丝酵母尿酸酶的表达、纯化与部分酶学性质研究
目的 研究重组产朊假丝酵母尿酸酶的高效表达条件、分离纯化和部分酶学性质.方法 选择在菌体对数生长末期加入诱导剂,通过摇瓶培养对异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)和乳糖诱导产酶的效果进行比较;利用50 L发酵罐研究诱导培养时间;通过Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析、Sephacryl S-200 HR层析纯化目的蛋白并研究其适pH值和酸碱稳定性、适温度及热稳定性.结果 摇瓶培养结果显示乳糖诱导效果优于IPTG.发酵罐培养工程菌,在对数生长末期添加乳糖诱导7 h后酶活力和生物量均达到大值,分别为164 U/g菌体和23 g菌体/L发酵液,即每升发酵液含酶活性3 772 U.纯化的尿酸酶比活性为4.5 U/mg,其适pH值为7.5,适温度40℃,酸碱稳定范围在pH值6.0～10.0,温度低于45℃ 时热稳定性较好.结论 以乳糖作为诱导剂培养效果更佳;带有His标签的重组尿酸酶经Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析和Sephacryl S-200HR分子层析后即可获得纯品,纯化流程更为简单;该纯化酶的适反应温度、适pH值、酸碱稳定性和热稳定性的确定为其结构与功能的关系以及未来的实际应用提供了一定的实验依据.
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His标签单克隆抗体的制备及交叉抗原的表位分析
目的 研究His标签对重组蛋白在疫苗、免疫和致病等方面的影响.方法 制备His标签的单克隆抗体(mAb),通过ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色方法研究其生物学特性、免疫反应特性以及与人体组织的反应性.结果 His标签mAb和抗原的结合与空间构型有关,多数抗His标签mAb可以与血红蛋白结合,亦可与人体多种正常组织反应.结论 带His标签的重组蛋白进行体内实验时可刺激机体产生抗His标签的抗体,该抗体可与血红蛋白及人体正常组织结合而影响重组蛋白的后期研究.
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His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
目的:制备和鉴定抗His标签单克隆抗体(mAb),初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法.方法:用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株.常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定.结果:His-tag完全抗原偶联成功,经细胞融合、筛选及克隆化,成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株.制备腹水测得腹水效价高于 1:106,且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应,并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果.结论:成功制备了1株His标签mAb,为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具.
