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问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位
目的:改建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL21基因核苷酸序列以提高表达产量并了解基因改建前后表达产物免疫原性变化,确定外膜脂蛋白LipL21在钩体表面的定位.方法:参照大肠杆菌偏爱密码子设计,合成lipL21基因核苷酸序列并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测改建前后lipL21基因表达量变化.采用钩体TR/Patoc Ⅰ抗血清为一抗的Western blot鉴定改建前后两种目的重组蛋白rLipL21s的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)比较改建前后rLipL21s抗血清对不同钩体血清群的交叉免疫凝集效价变化.应用免疫电镜技术对LipL21进行定位.结果:改建前后lipL21基因表达量分别为细菌总蛋白的8.5%和46.5%.两种rLipL21均能与TR/Patoc Ⅰ抗血清发生免疫结合反应,免疫家兔后均能产生特异性抗体.两种rLipL21兔抗血清对我国15群15型钩体参考标准株MAT效价相近,均为1∶80~1∶320.LipL21位于钩体外膜表面.结论:LipL21是钩体表面抗原.改建后的lipL21基因可明显提高原核表达产量,其产物可保持良好的抗原性和免疫反应性,其抗体具有广泛的交叉免疫凝集活性.
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问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定
目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别.方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位.采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组PⅢ.分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组PⅢ免疫杂交反应性.结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位.经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段.各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其Western Blot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定.结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位.共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位.差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象.