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沉默Cdk7导致pRb和Cdk2磷酸化水平下降并诱导HepG2细胞凋亡
目的研究转染反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)对Cdk7特异性的沉默作用及其对体外培养人肝细胞癌HepG2细胞pRb和Cdk2磷酸化水平以及细胞周期进展的影响,确定Cdk7作为抗肿瘤药物研发靶点的可行性.方法以免疫印迹检测转染ASODN对Cdk7 的特异性沉默作用及其对pRb和Cdk2磷酸化水平的影响;以流式细胞术测定转染ASODN后细胞DNA含量,确定细胞周期进展和凋亡情况,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态.结果转染ASODN 72 h后,Cdk7蛋白水平显著下降,有明显剂量-效应关系,高可降至对照组的0.12±0.05;在ASODN浓度>100 nmol.L-1时,pRb和Cdk2磷酸化水平显著下降,两种蛋白的磷酸化水平与给药剂量有明显依赖关系.随转染ASODN浓度上升及转染时间的延长,G0/G1期细胞、凋亡细胞比例迅速升高,与对照组比较,出现明显的G0/G1期阻滞(P<0.01)和细胞程序性死亡(P<0.01) ;透射电子显微镜观察显示>50 nmol·L-1各组细胞具特征性凋亡形态.结论用ASODN沉默Cdk7可降低pRb以及Cdk2的磷酸化水平,使其生物活性下降,对体外培养HepG2细胞可产生显著的G0/G1期阻滞,引起细胞周期延长和细胞凋亡,产生抗增殖作用,可以Cdk7作为抗肿瘤药物研发的新靶点.
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沉默CDK7基因对Hep G2细胞株的抗增殖作用
目的筛选对体外培养HepG2细胞抗增殖作用强的反义寡脱氧核苷酸(anti-senseoligodeoxynucleotides,ASODN)序列,探讨经二次优化后该ASODN片段的抗增殖作用.方法根据RNAStructure 3.71计算机软件模拟人CDK7 mRNA获得的二级结构确定待选ASODN,经OligoWalk程序分析这些片段与mRNA互补时的热力学参数变化,以此优选待筛ASODN,以体外培养人肝癌Hep G2细胞为筛选体系获得抗增殖作用强的ASODN,对该片段分别依次向互补区上、下游错位1～5个碱基获得10条ASODN,经结构优化后进行二次筛选.结果初筛结果显示互补于人CDK7 mRNA第284～303片段的部分硫代修饰ASODN抗增殖作用强,为(40.4±12.6)%;二次筛选显示互补于第287～306片段的全磷酸硫代修饰AS ODN抗增殖作用强,抑制率为(68.3±2.6)%,半数抑制浓度为(51.9±8.6)nmol/L.结论筛选得到的ASODN片段可显著抑制体外培养HepG2细胞的增殖,有可能作为先导化合物开发特异性CDK7抑制剂.
关键词： 细胞周期蛋白依赖激酶7 肝细胞癌 反义寡脱氧核苷酸 -
人细胞周期蛋白H基因的真核表达载体构建和表达及功能检测
细胞周期蛋白H(cyclin H)是一种含323个氨基酸,相对分子质量(Mr)为38 000的细胞周期调控蛋白,普遍存在于真核细胞中,可与细胞周期蛋白依赖性激酶7 (cyclin-dependent kinase 7,CDK7)共同参与细胞周期和基因转录的合理调控,其复合体可以催化各种CDK分子的活化,从而影响细胞增殖[1].Cyclin H可催化多种CDK(如CDK2、CDK4、CDK6)活化,能与CDK7、MAT1结合形成复合体(CDK7/cyclin H/MAT1),其功能是作为细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶(cyclin-dependent kinase-activating kinase,CAK),并进一步与转录因子2H(transcription factor 2H,TF2H)核心蛋白结合形成TF2H基本转录因子,而增强CDK以及RNA聚合酶2(RNA polymerase 2,RNAP2)大亚基羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain,CTD)的磷酸化.CAK也能够使p53、有机阳离子转运体1(organic cation transporter-1,Oct-1)以及维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)[2]、甾体激素受体等转录因子磷酸化[3],调节转录和DNA损伤修复,促使细胞发生分裂、增殖,并调控恶性肿瘤的发生与发展[4].
关键词： 人细胞周期蛋白H基因 真核表达 细胞周期蛋白依赖激酶7
