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稳定表达hOAT1的HEK293细胞系的建立及鉴定
目的 构建人肾脏近曲小管阴离子转运体1(human organic anion transporter 1,hOAT1)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒,获得稳定表达pEGFP-hOAT1的HEK-293细胞系.方法 构建EGFP与hOAT1的融合基因表达载体pEGFP-hOAT1,并利用FuGENE 6转染试剂将其转染至HEK293细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,经G418抗性筛选获得稳定转染细胞株.用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术,检测稳定转染细胞及正常细胞hOAT1 mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力,以及丙磺舒对hOAT1的抑制作用.结果 使用该文的方法,细胞转染率可达90％.RT-PCR、qRT-PCR、Western blot,以及对氨基马尿酸摄取、丙磺舒抑制实验结果显示,相对于正常组,转染细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光,其hOAT1表达均呈阳性(P<0.01);稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力明显升高(P<0.05),且丙磺舒对hOAT1有明显的抑制作用(P<0.05).结论 高效快速地建立了稳定高表达hOAT1的HEK293细胞系,为核苷类膦酸类似物这类药物引起的临床剂量依赖性肾毒性的机制研究奠定了模型基础,也为体外研究hOAT1底物或抑制剂的筛选提供了一个便利的工具.
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缺血再灌注损伤后大鼠肾小管上皮细胞有机阴离子转运蛋白的表达及其功能
目的 探讨大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)后肾小管上皮细胞有机阴离子转运蛋白(OAT)1和3表达及功能变化.方法 建立大鼠IRI模型,于术后第1、2、4、6天取血及肾组织标本.常规测定Scr浓度及观察肾脏组织形态.分别用免疫组织化学和Western印迹检测肾脏组织OAT1和3蛋白表达.毛细血管电泳仪检测肾脏对氨基马尿酸(PAH)排泄率.钼蓝分光光度法测定基侧膜钠-钾-ATP酶(Na+-K+-ATP酶)活性.另设假手术组作对照.结果 模型组大鼠术后第1天肾小管上皮细胞坏死脱落,管腔内可见大量管型,刷状缘消失,基底膜裸露;Scr显著升高.与假手术组比较,模型组大鼠肾组织匀浆及肾小管上皮细胞OAT1和OAT3表达增强;PAH排泄率降低[(0.53±0.15)比(4.00±0.67)ml/min,P＜0.01];肾小管上皮细胞基侧膜Na+-K+-ATP酶活性降低[(9.33±1.37)比(15.07±0.15)μmol Pi·(mg蛋白)-1·h-1,P＜0.01].损伤后第2天及第4天,损伤的肾小管逐渐修复,OAT1和3表达逐渐降低,PAH排泄率和Na+-K+-ATP酶活性逐渐增加;至第6天时肾小管基本恢复正常.结论 急性肾缺血再灌注导致大鼠肾小管上皮细胞可逆性损伤,损伤初期肾小管OAT1和OAT3表达增强,转运有机阴离子功能下降,PAH排泄减少.Na+-K+-ATP酶活性低下是OAT功能降低的主要机制之一.
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缩泉丸和真武汤对小鼠肾脏有机阴离子转运体Oat1和Oat3的影响
目的：初步检测缩泉丸和真武汤对小鼠肾脏有机阴离子转运体（Oats）中的2个主要亚型（Oat1，Oat3）的影响。方法以缩泉丸和真武汤及方中各药水煎剂、丙磺舒、氢氯噻嗪给NIH小鼠灌胃，每天2次，连续5 d，另设纯水对照组。末次给药后所有受试鼠逐一经尾静脉注入对氨基马尿酸（para-aminohippuric acid， PAH）30 mg·kg-1，然后在1，2.5，5，7.5，10，15，20 min时分别从各组各取10只小鼠处死收集全血，并迅速摘取双肾，测定血清及肾匀浆液中的PAH浓度，以药动学软件（DAS2.0）求出血清及肾组织匀浆液中PAH的主要药动学参数：消除半衰期（t1/2β），分布容积（Vd），清除率（CL）和药-时曲线下面积（AUC0-20 min）；从各组右肾提取总mRNA，以实时荧光定量PCR法比较小鼠肾脏中Oat1、Oat3 mRNA的表达量。另从各组各取10只小鼠，末次给药后1 h，断头处死后，取右肾做肾切片摄取PAH试验。结果与纯水对照组比较，真武汤组、茯苓组t1/2β显著延长（P<0.01），缩泉丸、乌药、附子各组t1/2β显著缩短（P<0.05，P<0.01）；缩泉丸、益智仁、山药、真武汤、白芍、生姜、茯苓各组Vd显著降低（P<0.05，P<0.01），附子组Vd升高（P<0.01）；缩泉丸、山药、真武汤、白术、生姜、茯苓各组CL均显著降低（P<0.05，P<0.01）；除益智仁、白芍、茯苓各组AUC0-20 min无显著变化外（P跃0.05），其他供试物组均显著增大（P<0.01）。各供试物组肾脏与血清AUC0-20 min比值均在0.247~0.475之间，与纯水对照组相似；肾切片摄取PAH试验显示，与纯水对照组比较，缩泉丸、乌药、山药、真武汤、白术、白芍、附子、生姜、茯苓各组摄取PAH量明显降低（P<0.05，P<0.01）。与纯水对照组比较，益智仁组、附子组小鼠肾脏Oat1 mRNA表达水平显著上调（P<0.01），而缩泉丸组、真武汤组Oat1 mRNA表达水平则显著下调（P<0.01）；缩泉丸、益智仁、附子各组小鼠肾脏Oat3 mRNA表达水平显著上调（P<0.01），而真武汤组Oat3 mRNA表达水平则显著下调（P<0.01）。结论缩泉丸及其君药益智仁、真武汤及其君药附子可能通过影响有机阴离子转运体的2个主要成员Oat1，Oat3的表达导致肾脏损伤。
