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人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达
目的：构建人HCN4基因的真核表达质粒并转染人胚胎肾细胞，建立异源性表达HCN4通道模型。方法：通过聚合酶链反应扩增人HCN4基因全长核苷酸序列，双酶切（ XhoI和EcoRI）后插入真核表达质粒pIRES2-EGFP中，构建重组真核表达质粒pIRES2-HCN4-EGFP。应用脂质体法将重组质粒pIRES2-HCN4-EGFP转染入HEK293细胞中进行表达。全细胞膜片钳技术检测HCN4通道电流。结果：酶切及测序的结果显示pIRES2-HCN4-EGFP构建成功，倒置荧光显微镜能观察到EGFP绿色荧光，反转录-聚合酶链反应检测到HCN4 mRNA表达，膜片钳检测到HCN4基因编码的通道电流。结论：成功建立异源性表达HCN4通道模型，为进一步研究HCN4通道电生理特性提供了实验基础。
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人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因体外转染乳鼠心肌细胞
目的 观察人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hHCN4)基因对大鼠心肌细胞搏动的影响,初步探讨hHCN4转染心肌细胞构建生物起搏器的可行性.方法 胰酶消化法分离培养原代乳鼠心肌细胞,随机分为实验组、空病毒对照组、空白对照组,转染时分别加入带hHCN4和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒、带GFP的腺病毒、PBS,观察分析心肌细胞转染前,转染后2天和3天的搏动情况;采用逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光检测各组心肌细胞hHCN4 mRNA和通道蛋白的表达.结果 hHCN4重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞后2天和3天较转染前搏动频率明显增加,频率高于对照组;hHCN4重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞后,可检测到hHCN mRNA和通道蛋白表达,而对照组无表达.结论 hHCN4转染心肌细胞的搏动频率增加, hHCN4基因转导入心肌细胞构建生物起搏器的方法具有初步可行性.
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风心二狭房颤患者心房组织的HCN4基因表达及动作电位的研究
目的:通过分析风湿性心脏病二尖瓣狭窄(风心二狭)患者心房肌组织HCN4基因表达及动作电位与心房颤动发生的关系,为风心二狭房颤发生机制的研究提供理论依据.方法:取手术患者心耳组织100 mg,提取RNA后应用半定量逆转录—PCR方法检测mRNA含量,并对PCR产物测序分析；以HCN4基因mRNA和内参β-actin含量的比值作为评价HCN4基因mRNA表达水平指标；采用急性分离心肌细胞的方法将其分为MS房颤(atrial fibrillation,AF)组和窦律(Sinus rhythm,SR)组,记录两组的动作电位(AP),观察两组心肌细胞动作电位时程( APD)的改变.结果:风心二狭房颤组及对照组HCN4基因mRNA与β-actin含量的相对表达值比值分别为0.696±0.257和0.125±0.010,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).房颤病人心房肌APD、APD复极至50％的时程(APD50)及APD复极至90％的时程(APD90)较窦性心律组明显缩短,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:房颤心肌细胞HCN4基因的过度转录表达及APD缩短可能共同参与了调控风心二狭房颤的发生过程,揭示了风心二狭房颤发生的分子机制及电流学机制.
关键词： HCN4基因 风湿性心脏病二尖瓣狭窄 心房纤颤 动作电位 -
HCN4基因心脏起搏机制与心律失常关系研究进展
HCN4基因编码超级化激活阳离子电流(If)通道结构蛋白,具有调节心脏起搏的功能,心脏上注射HCN4基因转染的心肌细胞可以起到生物起搏作用.HCN4与各种心律失常关系密切,家族性窦性心动过缓等遗传性心律失常患者HCN4基因外显子碱基的缺失或颠换突变导致HCN4通道蛋白的改变,引起If幅度减少,属于常染色体显性遗传.心力衰竭、心肌肥厚、心房颤动等获得性心律失常患者HCN4基因的表达上调,可以使If增大,导致心律失常发生.
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质粒shRNA体内干扰Klotho基因对窦房结通道基因的影响
通过质粒shRNA体内干扰,研究Klotho基因与窦房结起搏通道相关基因HCN4及HCN2之间的关系,为病窦综合征的研究提供新思路.取C57BL/6J小鼠20只,分为4组,每组5只,分别为:质粒shRNA 24 h组、质粒shRNA 12 h组、生理盐水24 h组、生理盐水12h组.质粒shRNA组经尾静脉注射质粒shRNA 50 μL(1 μg质粒/μL),生理盐水组经尾静脉注射生理盐水50 μL.分别于注射12h及24 h后取窦房结周围组织,行RT-PCR检测各组小鼠的Klotho、HCN2、HCN4基因的mRNA水平.RT-PCR结果显示:与生理盐水12h组比较,shRNA 12 h组的klotho、HCN4和HCN2的mRNA表达量明显降低,均有统计学差异(P＜0.05).以上结果提示,小鼠Klotho基因和窦房结起搏基因可能存在一定关系.
