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用流式细胞仪进行人核迁移蛋白shRNA有效干扰片段的分析和筛选
目的 为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H.方法 将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体；将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.载体中；将shNUDC-A、B、C、D、E、F、H各个片段分别克隆至含有U6启动子的载体中,形成一系列RNA干扰载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H；将提取高质量的质粒通过脂质体方法转染293T细胞.用流式细胞仪分析转染的293T细胞的荧光强度和荧光细胞数量,用实时荧光相对定量RT-PCR(real-time PCR)检测NUDC-RFP mRNA的转录情况,用Western Blot法检测NUDC-RFP融合蛋白的表达水平.结果 流式细胞仪检测结果显示:空白对照组的293T细胞无发光细胞；阴性对照组的293T细胞能正常发光,且发光细胞数量较多；实验组的293T细胞发光细胞数量少,荧光强度低,说明其能有效干扰NUDC RFP融合基因的表达,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F干扰下调效果约90％左右；pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A可干扰hNUDC RFP融合基因的表达,下调效果约85％左右；其他干扰片段pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H下调效果在62％～75％；阴性对照组对融合基因无干扰效果；流式细胞仪检测结果与real-time PCR检测结果一致,也与Western Blot法的鉴定结果基本符合,并确定了shNUDC-F为RNA干扰效果佳的干扰片段.结论 流式细胞仪分析方法是一种有效的带荧光标记的RNA干扰载体的筛选方法,为后期研究打下了基础.
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人核迁移蛋C刺激人造血干细胞增殖分化为巨核细胞研究
目的:研究人核迁移蛋C(hNUDC)促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、分化为巨核细胞的作用.方法:使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞, 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后, 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、中、大巨核细胞集落的形态、数目的影响;无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后, 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响.结果:hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFU-MK集落, 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达, CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素.结论:hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用.
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人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达
目的: 制备人核迁移蛋白(hNudC )的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET-28b/hNudC, 表达带有6-His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性.结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(ê) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶ 64和1∶ 32; 腹水mAb的效价分别为1∶ 1×105和1∶ 5×104.mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg-01和人脐带血来源的CD41+巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白.结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础.
