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脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察
[目的]采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架,为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架.[方法]取SD大鼠胸段脊髓约2 cm,运用冻融+化学萃取(3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、RNaseA)的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态.[结果]经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核.髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分.[结论]本实验采用冻融+化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构.
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大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原性研究
[目的]评价脱细胞脊髓支架的免疫原性,为其在组织工程中的应用奠定理论基础.[方法]将脱细胞脊髓(冻融+3%脱氧胆酸钠+DNase,RNase消化)及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内,于术后1～4周分别取材进行组织学观察,通过HE染色评价炎症反应程度;应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度,评价免疫排斥反应强度.[结果]组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应,脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,但2周后只有少量淋巴细胞浸润;新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,术后4周仍有大量淋巴细胞浸润;与新鲜异体脊髓移植比较,化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低,但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在.[结论]移植经化学去细胞处理的异体脊髓后,仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应,具有良好的组织相容性,并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料.
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京尼平交联对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响
目的 探讨新型生物交联剂京尼平对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响.方法 从成年SD大鼠(体质量200 ～ 250 g,雌雄不限)获取大鼠胸段脊髓,采用化学萃取法对大鼠脊髓组织进行脱细胞处理,再用生物交联剂京尼平(5 g/L)进行化学交联.分别采用HE染色和扫描电镜观察京尼平交联前后脱细胞脊髓的微观结构,并进行孔径大小、交联率、含水量、在PBS溶液及胰酶溶液中的稳定性能检测,再将大鼠骨髓间充质干细胞分别与京尼平交联前后的脱细胞脊髓浸提液共培养,采用MTT法在体外评估该支架材料交联前后的细胞毒性情况.结果 京尼平交联前后的脱细胞脊髓拥有类似的多孔结构,孔径大小约30μm,终交联率可达90％,交联后的脱细胞脊髓含水率从(283.4±11.2)％降至(229.7±12.5)％,但其在PBS及胰蛋白酶中的稳定性得到了明显的增强.交联前后的脱细胞脊髓都未观察到明显的细胞毒性.结论 京尼平交联的脱细胞脊髓部分生物学特性得到改善,为应用于脊髓损伤修复的组织工程材料提供了一种新的选择.
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2种去细胞方法制备大鼠脱细胞脊髓支架效果的对比研究
目的 比较脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶2种脱细胞方法制备脱细胞的同种异体脊髓支架的效果.方法 取成年SD大鼠胸段脊髓2 cm,运用冻融+化学萃取的组织工程学方法(脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶)处理大鼠脊髓组织,对处理后的脊髓支架分别进行HE染色,髓鞘染色和扫描电镜观察.结果 2种方法均较为完全地脱去了细胞和髓鞘成分,脊髓横断面上呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核.结论 采用冻融+化学萃取的2种组织工程学方法均可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架.
关键词： 脱细胞脊髓 组织工程支架 大鼠 脱氧胆酸钠 triton X-100 -
脱细胞脊髓支架的成分分析
目的 探讨同种异体脱细胞脊髓支架的制备方法并分析其可能含有的有效成分.方法 采用冻融+化学萃取方法制备脱细胞脊髓支架,光镜及扫描电镜观察其结构特征;用免疫组织化学法分析脱细胞支架的主要成分.结果 正常的大鼠脊髓组织经脱细胞处理后,清除了所有的细胞成分及髓鞘和轴突,扫描电镜显示保存了细胞外基质成分构成了三维支架结构.成分分析结果显示,存留的支架结构中含有层黏连蛋白(laminin, LN)、纤连蛋白(fibronectin, FN)、Ⅳ型胶原等诱导和促进神经再生、促进细胞黏附和增殖的重要成分.结论 脱细胞异体脊髓具有三维支架结构,含有诱导和促进神经再生的相关蛋白,有利于受损神经的再生及移植细胞的存活和增殖.
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京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的制备及其生物力学特性研究
目的 构建京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架,探讨京尼平交联改性对大鼠脱细胞脊髓支架抗酶解能力、生物力学性能及细胞毒性的影响. 方法 采用化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架,再用5 g/L京尼平溶液进行化学交联改性.采用HE染色及扫描电镜观察未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的微观结构,测量基质孔径大小.分别检测交联前后大鼠脱细胞脊髓支架的孔隙率、含水率以及在2.5 g/L胰酶溶液中的失重率.在Instron生物力学测试仪上检测正常大鼠胸段脊髓、未交联及京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的极限牵张应力和弹性模量.将大鼠骨髓间充质干细胞分别在未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架浸提液中培养,采用MTT法检测细胞相对生长率,评价支架的细胞毒性. 结果 未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有相似的三维网状孔隙结构,孔径大小约30 μm,孔隙率超过80％,两组间差异无统计学意义(P＞0.05)；京尼平交联支架的含水率为(229.7±12.5)％,显著低于未交联支架的(283.4±11.2)％(P＜0.05)；京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架在胰酶溶液中各时相点的失重率明显低于未交联支架(P＜0.05),生物力学测试其极限牵张应力和弹性模量则显著增强(P＜0.05)；未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架均未观察到明显的细胞毒性. 结论 京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有与未交联支架相似的结构,但生物力学性能和抗酶解能力明显增强,且无明显细胞毒性,在脊髓损伤修复的组织工程研究中具有良好的应用前景.
