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结核分枝杆菌 mpt59和 esxA 融合基因编码蛋白的原核表达及免疫原性观察
目的：获取结核分枝杆菌mpt59和esxA基因编码的原核表达融合蛋白，并将该蛋白初步用于结核患者的快速诊断。方法：PCR扩增含有柔性链接肽段的esxA核苷酸序列，并将其连接至原核表达载体pET28a上，再将mpt59连接至pET28a-esxA上。该融合蛋白在大肠杆菌BL21中原核表达后，用镍珠子进行亲和纯化。采用垂直电泳和免疫印迹分析重组蛋白，并用于结核患者的诊断。结果：成功构建了原核表达载体pET28a-esxA-mpt59，转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。用该纯化蛋白进行ELISA检测，结果表明其诊断结核的灵敏度为97．8％，特异度为100％。结论：构建了含mpt59和esxA融合抗原基因的原核表达载体，并诱导表达了融合蛋白，为进一步研究结核分枝杆菌疫苗或诊断试剂奠定了基础。
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金黄色葡萄球菌EsxA基因的克隆及表达
目的 在原核质粒中克隆金黄色葡萄球菌(S.aureus)EsxA基因,并进行表达及纯化,为其功能研究奠定基础.方法 根据GeneBank中S.aureus EsxA序列,设计特异性引物PCR扩增EsxA基因,PCR产物纯化后经EcoRI和XhoI双酶切,连接至pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,His柱纯化重组EsxA蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白的表达.结果 成功克隆EsxA基因,基因全长294 bp,起始于ATG,终止于TAA,预测的分子量为11 036.2,等电点为4.61,经双酶切在294 bp处可见目的条带,基因测序显示EsxA在正确阅读框内,提示重组蛋白构建成功.SDS-PAGE显示重组蛋白在分子量大约14.5×103Mr处左右见到可溶性的蛋白表达,Western blot分析识别14.5×103Mr重组蛋白.结论 在大肠杆菌中成功克隆表达EsxA蛋白,为其功能研究奠定基础.
