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EB病毒潜伏性膜蛋白1促原代MEF细胞永生化的作用及机制
为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促原代小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞增殖规律及作用机制,构建包含野生型LMP1和其TNFR相关死亡区(TRADD)结合区即羧基末端384～386氨基酸置换(YYD→ID)的突变型LMP1逆转录病毒,感染原代培养的MEF细胞,动态观察各细胞在传代培养过程中细胞动力学和形态学变化.发现对照细胞(MEF-LNSX)传至P8～P10时出现明显的生长阻滞;携突变型LMP1的细胞(MEF-LMP1TRADD)自P10起倍增时间逐渐延长,P19时出现明显生长阻滞;而携野生型LMP的细胞(MEF-LMP1)倍增时间逐渐降低并发生了永生化.Western blot检测发现MEF-LNSX细胞CyclinA表达自P4起明显降低,MEF-LMP1TRADD细胞自P10显著增高后快速降低,MEF-LMP1自P10显著增高后一直维持在较高水平.结果表明:LMP1能促进MEF细胞增殖并诱导体外永生;LMpTRADD则仅能诱导MEF细胞的早期增殖.提示羧基末端区(TRADD)是LMP1促MEF细胞永生的重要活性部位,上调CyclinA表达可能是其作用机制之一.
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LMP1羧基末端第三活性区对鼻咽上皮细胞生物学特性的影响
目的 探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1 (LMP1)羧基末端第三活性区在鼻咽上皮细胞生长中的作用. 方法 采用逆病毒感染的方法,建立稳定表达野生型LMP1(LMP1WT)和突变型LMP1(LMP1△232-351)的鼻咽上皮细胞(NP69)系,然后通过细胞生长曲线、平皿克隆形成与软琼脂集落实验、细胞周期与抗凋亡检测等方法,观察LMP1羧基末端第三活性区对鼻咽上皮细胞生物学特性的影响. 结果 LMP1△232-351体外促转化细胞生长能力较LMP1WT明显降低(P<0.01);NP69-LMP1△232-351 细胞的凋亡与细胞G1期分布均较NP69-LMP1WT细胞增加(P<0.01). 结论 LMP1羧基末端第三活性区可能通过调节细胞周期与凋亡而影响鼻咽上皮生物学特性.
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EB病毒潜伏性膜蛋白1转化NP69细胞的蛋白表达分析
目的 探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)转化鼻咽上皮细胞NP69的表达蛋白. 方法 采用比较蛋白质组学方法 ,鉴定NP69-pLNSX与NP69-LMP1细胞系中的差异表达蛋白,分析LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白. 结果 鉴定了LMP1在NP69细胞中参与调节有22个蛋白(表达上调的蛋白9个,下调的13个). 结论 LMP1在NP69细胞中可能通过调节Vimentin和Keratin 19等蛋白的表达而起转化作用.
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NF-κB介导的EBV-LMP1在Rat-1细胞转化和成瘤中的作用
背景与目的:EB病毒潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)是病毒基因组编码的致瘤蛋白.本研究拟探讨LMP1在细胞转化和致瘤过程中的作用机制.方法:采用基因重组方法构建LMP1和显性负突变IкBα逆转录病毒质粒pLNSX-LMP1和pBabe-IкBα,分别与含有转录因子NF-кB启动子的荧光素酶表达质粒共转染293细胞,单光子检测仪测定LMP1对NF-кB的活化作用及IкBα对NF-кB的抑制作用;同时将2种重组病毒载体分别导入PA317细胞包装,获取2种逆转录病毒(retrovirus,RV),单独(RV-LMP1)或先后(先RV-LMP1后RV-IкBα)感染体外培养的Rat1细胞,检测转导细胞的集落形成能力及裸鼠成瘤能力.结果:当pBabe-IкBα与pLNSX-LMP1以1∶1共转染,IкBα能使LMP1活化NF-кB的作用降低75%;当以3∶1共转染,LMP1的活化作用几乎全部被抑制.IкBα能明显抑制RV-LMP1感染细胞的恶性表型:平皿克隆形成数从368±7和287±17分别降至59±6和8±2(n=3,P＜0.001);软琼脂集落形成数从477±13和347±10分别降至61±15和95±7(n=3,P＜0.001);裸鼠成瘤能力显著降低,瘤体积自(1.61+0.23)cm3降至(0.20±0.08)cm3(n=5,P＜0.001).结论:EB病毒LMP1促Rat1细胞恶性转化作用主要依赖NF-кB的活化.
