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RelA与uPA在卵巢癌细胞系中表达的相关性研究
目的探讨RelA对人卵巢癌细胞株A2780、OVCAR-3 uPA合成的影响.方法用RelA、IкBα反义寡核苷酸(ASODN)处理A2780、OVCAR-3细胞株,然后以Westem Blot、RT-PCR检测RelA、uPA的表达以及RelA在蛋白、mRNA水平对uPA的调节作用.结果 RelA表达与uPA蛋白及mRNA表达水平均呈明显正相关.RelAASODN下调uPA的表达与其作用时间相().结论用RelA ASODN抑制RelA表达可明显下调uPA的表达.
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强化胰岛素对严重烧伤大鼠心肌细胞TNF-α表达的抑制作用
目的 探讨强化胰岛素对严重烧伤大鼠心肌细胞僻TNF-α表达的抑制作用及其可能机制.方法 健康雄性SD大鼠18只,右颈静脉及左心室插管,随机均分为3组:假伤组,大鼠给以假烫;烧伤组,制作30%TBSAⅢ度烫伤后,常规给以液体复苏;强化组,烫伤后给以强化胰岛素治疗,液体总量同烫伤组.测定伤后0、1、2、3、4、5、6h的血糖及左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LV-EDP).伤后6h处死动物,留取左心室组织,分别用ELISA和定量PCR法测定TNF-α蛋白及其mRNA水平,Western blot观察p-IкBα口和IкBα变化.同时用烧伤血清培养新生鼠心肌细胞,观察胰岛素及其活化抑制剂LY294002对p-IкBα水平的影响.结果 与假伤组比较,烧伤组动物伤后出现应激性高血糖反应,LVSP降低,LVEDP升高,左心室组织1NF_a蛋白及mRNA水平升高,p-IкBα蛋白表达增高,IкBα蛋白表达降低(P＜0.05或0.01).烧伤大鼠经强化胰岛素治疗后,血糖维持在4.5～5.2mmol/L之间,左心室功能得到明显改善,左心室组织TNF-α蛋白及mRNA水平显著降低,кBα的磷酸化和降解明显减轻(P＜0.05或0.01).LY294002能够消除胰岛素对烧伤血清培养心肌细胞кBα磷酸化的抑制作用.结论 强化胰岛素可能通过减少IкBα的磷酸化降解而降低NF-кB活化,进而抑制心肌细胞TNF-α的转录与表达,发挥改善心肌功能的作用.
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应用巢式PCR法克隆N端部分缺失的IкBα基因
目的克隆中国人N端部分缺失的IкBα基因,为进一步应用其进行抗肿瘤基因治疗研究打下基础.方法从中国人外周血中分离单核细胞,采用多聚赖氨酸贴壁刺激0.5h后提取总RNA.应用逆转录PCR法,以自行设计的引物扩增全序IкBα基因,应用巢式PCR法扩增N端部分缺失的IкBα基因,用TA克隆技术将目的基因连接到pGEM-T质粒载体中,进行测序并与已知IcBa序列进行同源性分析.结果测序结果表明我们所克隆的目的基因,其基因序列与CenBank中人IкBa基因序列仅有5个碱基不同但所编码氨基酸仅1个发生改变.结论已成功克隆了中国人N端部分缺失的IкBα基因,为进一步应用N端部分缺失的IкBα基因进行抗肿瘤基因治疗研究打下了基础.
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NF-κB介导的EBV-LMP1在Rat-1细胞转化和成瘤中的作用
背景与目的:EB病毒潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)是病毒基因组编码的致瘤蛋白.本研究拟探讨LMP1在细胞转化和致瘤过程中的作用机制.方法:采用基因重组方法构建LMP1和显性负突变IкBα逆转录病毒质粒pLNSX-LMP1和pBabe-IкBα,分别与含有转录因子NF-кB启动子的荧光素酶表达质粒共转染293细胞,单光子检测仪测定LMP1对NF-кB的活化作用及IкBα对NF-кB的抑制作用;同时将2种重组病毒载体分别导入PA317细胞包装,获取2种逆转录病毒(retrovirus,RV),单独(RV-LMP1)或先后(先RV-LMP1后RV-IкBα)感染体外培养的Rat1细胞,检测转导细胞的集落形成能力及裸鼠成瘤能力.结果:当pBabe-IкBα与pLNSX-LMP1以1∶1共转染,IкBα能使LMP1活化NF-кB的作用降低75%;当以3∶1共转染,LMP1的活化作用几乎全部被抑制.IкBα能明显抑制RV-LMP1感染细胞的恶性表型:平皿克隆形成数从368±7和287±17分别降至59±6和8±2(n=3,P＜0.001);软琼脂集落形成数从477±13和347±10分别降至61±15和95±7(n=3,P＜0.001);裸鼠成瘤能力显著降低,瘤体积自(1.61+0.23)cm3降至(0.20±0.08)cm3(n=5,P＜0.001).结论:EB病毒LMP1促Rat1细胞恶性转化作用主要依赖NF-кB的活化.
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重组突变型IкBαcDNA对CNE1鼻咽癌细胞凋亡的诱导作用
目的:探讨突变型IкBα cDNA对CNE1鼻咽癌细胞凋亡的作用.方法:应用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)首先从CNE2鼻咽癌细胞中扩增突变型IкBα cDNA并将其克隆到pCLXSN逆转录病毒载体.然后,用脂质体介导的方法将含有该突变型IкBα cDNA的重组逆转录病毒载体转移到CNE1鼻咽癌细胞并用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术分析转染细胞凋亡情况.结果:通过RT-PCR技术,从CNE2鼻咽癌细胞扩增到IкBα cDNA并成功将其克隆到pCLXSN载体.将该重组逆转录病毒载体转染CNE1细胞约48小时后,Annexin V阳性细胞数为66.67%,而仅转染空白pCLXSN载体的CNE1细胞,Annexin V阳性细胞数为4.1%.结论:突变型IкBα cDNA能够诱导CNE1鼻咽癌细胞凋亡的发生.
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核因子-кBp65与IкBα在口腔白斑及鳞癌中的表达
腔鳞癌(OSCC)中的表达及其关系.方法:应用免疫组织化学技术检测正常口腔黏膜上皮(n=10)、OLK(n=46)及OSCC(n=36)中的NF-кBp65、IкBα表达.结果:NF-кBp65在正常口腔黏膜、单纯增生型OLK、异常增生型OLK及OSCC的表达率分别为:0%、9.09%、42.86%、72.22%,4组之间差异具有统计学意义(P＜0.05);IкBα在4组中呈动态表达,分别为:10%、81.82%、48.57%、86.11%,4组之间差异具有统计学意义(P＜0.05).NF-кBp65与IкBα的表达在OLK癌变过程中呈负相关(P＜0.05),在癌组织中呈正相关(P＜0.05).结论:二者可能是检测OLK的恶变潜能及OSCC早期诊断的敏感指标.
