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铁调素对敲降斑马鱼中抑制成骨代谢的影响
目的 通过对斑马鱼受精卵进行显微注射剪接吗啉环反义寡核苷酸,使其铁调素基因敲降,观察铁调素表达抑制后对斑马鱼骨代谢的影响,探讨铁调素抑制对于骨代谢影响的机制.方法 以受精后0.5h斑马鱼的受精卵为模型,予以不同浓度的剪接吗啉环反义寡核苷酸显微注射受精卵,将注射后的幼鱼于第4天进行提取RNA,反转录成cDNA,进行鉴定后得到适当浓度.在浓度为25 mg/L的剪接吗啉环反义寡核苷酸注射条件下,对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后的幼鱼于第4天进行铁染色,与野生型比较观察铁含量变化,对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后的幼鱼于第9天分别进行茜素红和阿可辛蓝染色,与野生型比较硬骨和软骨的形态差异;对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后的幼鱼于第4天提取的cDNA采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测相关成骨代谢的基因表达,比较和野生型基因组成骨下游基因的差异.对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后第4天斑马鱼予以成骨代表性的两个基因Runx2a和sp7进行原位杂交,比较野生型的幼鱼相关成骨基因表达部位的差异和信号强弱.结果 对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后第4天斑马鱼进行铁染色,与野生型染色比较色素沉着明显变深,对注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后第9天斑马鱼进行茜素红和阿尔辛蓝染色分别与野生型染色比较,硬骨茜素红染色变浅且肋骨及尾鳍未发育,软骨阿尔辛蓝染色未有明显改变,注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后第4天的斑马鱼行FQ-PCR进行检测相关成骨代谢的基因表达量与野生型斑马鱼成骨基因表达比较均下调,尤其以Runx2a和sp7为显著,野生型分别为1.00790±0.011 17和1.124 50±0.17607降至处理后的0.256 39±0.016 07和0.331 47±0.074 36.对于注射剪接吗啉环反义寡核苷酸后第4天斑马鱼进行Runx2a和sp7原位杂交的信号表达弱于同期野生型的斑马鱼.结论 敲降斑马鱼的铁调素造成斑马鱼体内铁蓄积,使得斑马鱼的成骨基因降低,造成骨发育迟缓,骨量减低.
