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短发夹RNA稳定沉默Y盒结合蛋白-1基因的人肺腺癌A549细胞株的建立及增殖能力研究
目的 构建稳定沉默Y盒结合蛋白1(YB-1)基因的人肺腺癌A549细胞株并观察其增殖能力.方法 以脂质体将两种沉默YB-1基因的shRNA真核表达载体转染人肺腺癌细胞株A549,G418筛选稳定转染细胞株.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Westem blot法检测YB-1基因表达;噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线.结果 稳定转染细胞株稳定表达绿色荧光蛋白(GFP);RT-PCR、FQ-PCR和Western blot法检测结果显示稳定转染组细胞株A549-746与A549-326 YB-1 mRNA和蛋白表达(0.41±0.01与0.39±0.06、0.43±0.10与0.20±0.24、0.49 ±0.06与0.24±0.02)较对照组明显下降(P＜0.05);噻唑蓝(MTT)检测稳定转染组较对照组生长速度降低(P＜0.05).结论 成功建立稳定表达GFP,并稳定沉默YB-1基因的人肺腺癌细胞株A549-746和A549-326,沉默YB-1可抑制A549细胞增殖能力.
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YB-1沉默点突变载体对YB-1基因敲除表型的回复
目的 Y盒结合蛋白-1(YB-1)在多种肿瘤中表达,并在转录和翻译水平调控相关癌基因中表达.为了进一步研究肺鳞癌细胞中YB-1的功能,构建了4个YB-1短发夹RNA(shRNA)干扰质粒pYr-1.1-YB-1-shRNA及YB-1沉默点突变质粒pYr-ads-1-YB-1 M.方法 pYr-1.1-YB-1-shRNA瞬时转染NIH293细胞,RT-PCR检测YB-1 mRNA,筛选抑制效率高的质粒,并稳定转染人肺鳞癌细胞株 SK-MES-1,Western blot检测YB-1及PARP蛋白,免疫荧光检测核酸内切酶G(Endo G)亚细胞定位.针对干扰效率高的靶序列,应用点突变PCR在YB-1基因表达质粒pYr-ads-1-YB-1上构建包含靶序列两个沉默点突变的质粒pYr-ads-1-YB-1 M.将pYr-1.1-YB-1-shRNA与pYr-ads-1-YB-1或pYr-ads-1-YB-1 M共转染SK-MES-1细胞,Western blot检测YB-1及PARP蛋白的表达.结果 4个pYr-1.1-YB-1-shRNA中2个干扰效率在60％以上,高抑制率为70.3％；pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒稳定转染SK-MES-1细胞能有效抑制YB-1蛋白的表达,并促进PARP蛋白的剪切及Endo G蛋白易位入核；pYr-ads-1-YB-1 M能回复pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒所致的YB-1蛋白表达抑制,PARP蛋白剪切. 结论 pYr-1.1-YB-1-shRNA特异性地通过抑制SK-MES-1细胞中YB-1的表达诱导细胞凋亡.
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YB-1通过激活Notch受体信号通路抑制肺鳞癌细胞凋亡研究
目的 探讨肺鳞癌中YB-1是否通过激活Notch受体信号通路发挥凋亡抑制作用.方法 将YB-1干扰质粒pYr-1.1-YB-1-shRNA和野生表达质粒pYr-ads-1-YB-1分别转染肺鳞癌细胞株SK-MES-1,Western blot检测YB-1、RT-PCR检测Notch受体信号通路靶基因Hes1的表达;pYr-ads-1-YB-1瞬时转染SK-MES-1细胞,DAPT抑制Notch受体信号通路,Annex-in V-PI双染法检测凋亡.结果 (1)YB-1可正调控Notch受体信号通路靶基因Hes1的转录;(2)YB-1过表达可显著抑制顺铂诱导的凋亡,DAPT抑制Notch受体信号通路后解除了YB-1的凋亡抑制作用.结论 YB-1可通过激活Notch受体信号通路抑制肺鳞癌细胞凋亡.
关键词： 肺肿瘤 Y盒结合蛋白-1 Notch受体信号通路 凋亡 -
沉默Y盒结合蛋白-1表达抑制SH-SY5Y细胞增殖促其凋亡的作用与机制
目的:观察短发夹RNA(shRNA)沉默Y盒结合蛋白-1(YB-1)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、凋亡的影响及其调控机制.方法:构建针对YB-1的短发夹RNA真核表达载体,利用LipofectamineTM 2000脂质体转染SH-SY5Y细胞,检测蛋白表达水平,鉴别干扰效果;四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测干扰与否对SH-SY5Y细胞增殖的影响;流式细胞技术分析干扰与否对SH-SY5Y细胞凋亡的影响;Western blot法检测CyclinD1、Bcl-2及Bax在蛋白水平的变化.结果:Western blot结果显示转染组YB-1表达低于对照组和无效转染组,后两组无显著差异;MTT法检测显示转染组细胞增殖水平低于对照组,无效转染组细胞增殖水平接近对照组;流式细胞术检测结果显示转染组凋亡细胞数占总细胞数的(23.21±1.90)%,高于对照组(5.05±0.83)%(P<0.01),无效转染组(6.24±1.05)%与对照组无显著性差异(P>0.05);Western blot技术检测转染组CyclinD1、Bcl-2蛋白水平较对照组明显下降,Bax升高,无效转染组同对照组无明显差异.结论:shRNA介导的YB-1表达沉默可抑制SH-SY5Y细胞CyclinD1、Bcl-2表达,促进Bax表达,进而抑制细胞增殖、促进凋亡.
