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微小RNA-370-3p对胶质瘤细胞U251增殖的影响及机制
目的 探讨miR-370-3p、β-连环蛋白(β-catenin)在人脑胶质瘤组织中的表达及其与胶质瘤细胞株U251恶性增殖的相关性.方法 (1)收集武汉大学人民医院神经外科自2014年9月至2015年3月手术切除的20例胶质瘤组织和同期行减压术切除的10例正常脑组织标本,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-370-3p表达,Western blot检测β-catenin蛋白表达,并对胶质瘤组织中两者表达进行相关性分析.(2)将体外培养的U251细胞分别转染miRNA无义序列和miR-370-3p模拟物,48h后RT-qPCR检测细胞中miR-370-3p、β-catenin mRNA表达,Western blot检测β-catenin蛋白表达.(3)双荧光素酶实验检测miR-370-3p对β-catenin编码基因CTNNB1基因的靶向调控作用.(4)细胞计数试剂盒(CCK-8)法和平板克隆形成实验综合评估转染后细胞的增殖能力.(5)共转染miR-370-3p模拟物与β-catenin pcDNA3质粒进行逆转实验进一步分析两者之间的功能联系.结果 (1)miR-370-3p在人脑胶质瘤中表达低于正常脑组织,且miR-370-3p在低级别胶质瘤(Ⅰ级和Ⅱ级)、高级别胶质瘤(Ⅲ级和Ⅳ级)胶质瘤中的表达量逐渐降低(对照组比低级别组比高级别组:3.67±1.65比4.94±1.08比2.37±1.11),与β-catenin蛋白表达呈负相关(R2=0.8868),差异有统计学意义.(2)与无义序列转染组比较,miR-370-3p模拟物转染组U251细胞中miR-370-3p表达显著增加(模拟物转染组比阴性对照组:174.33±23.08比1.03±0.30),β-catenin mRNA表达无明显改变,但β-catenin蛋白表达明显降低.双荧光素酶实验结果显示,转染miR-370-3p后野生型报告质粒的荧光素酶活性较对照组降低约40%,且差异有统计学意义(P=0.021).(3)上调miR-370-3p表达后,U251细胞增殖能力较对照组明显降低,克隆形成能力减弱(模拟物转染组比阴性对照组:30.00±7.00比63.33±4.04;P=0.004).(4)逆转实验结果发现,上调β-catenin的表达可以部分逆转miR-370-3p对U251细胞的生长抑制现象(miR-ctrl+CTNNB1组比miR-370-3p+vector组比miR-370-3p+CTNNB1组:78.33±6.03比31.33±4.51比63.00±5.57).结论 miR-370-3p可以通过转录后调控β-catenin,抑制胶质瘤细胞U251恶性生长.
关键词： 神经胶质瘤 U251细胞 微小RNA-370-3p β-连环蛋白 增殖
