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幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的克隆、表达及纯化
目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的原核表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础.方法 从前期已构建好的融合表达质粒pET32a(+)/UreI中,酶切目的 基因UreI,并胶回收目的 基因片段,将目的 基因UreI与载体pQE3.0分别经HindIlI和KpnI双酶切、纯化、连接,转化并筛选含有目的 基因的重组质粒pQE30/UreI,并在E.coli BL21中表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析.结果 经KpnI、HindIII双酶切后,小片段大小为585 bp,为插入的基因片段Hp UreI基因,经KpnI、NbaI双酶切,小片段为1 749 bp,与实验设计相一致.重组质粒pQE30/Urel经SDS-PAGE分析显示,在原核细胞中得到了高效表达,目的 蛋白分子量为21 kD左右,以包涵体形式表达.通过Quantity-one软件分析,其表达量约占菌体总蛋白的20%.经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达90%以上,Western blot分析显示,该目的 蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的免疫原性.结论 成功地克隆和构建了原核表达载体pQE30/UreI,并在原核细胞中得到了高效表达.
关键词： 幽门螺杆菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表达 -
幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化
目的 构建幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coli BL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础.方法 利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的 基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接.筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a(+)/UreI融合蛋白.表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析.结果 经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417609序列完全一致,无碱基突变.经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性.结论 成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a(+)/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达.
关键词： 幽门螺杆菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表达
