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过表达PrLZ对前列腺癌LNCaP细胞体外侵袭潜能的影响
背景与目的:前列腺亮氨酸拉链(prostate leucine zipper,PrLZ)基因是新近发现的与前列腺癌高度相关的新基因.初步研究提示其高表达与前列腺癌的恶性进展有关.我们的前期研究发现过表达PrLz可以增强LNCaP细胞的体外生存能力,本研究拟探讨其对LNCaP细胞的体外侵袭潜能的影响及可能的机制.方法:应用Lipofectamine 2000将PrLZ重组表达质粒转染至LNCaP细胞,经G418筛选获得稳定高表达PrLz的LNCaP/PrLZ细胞.Transwe11检测PrLZ表达变化对LNCaP细胞体外迁移及侵袭能力的影响.Western blot及明胶酶谱检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达水平及活性的变化.结果:迁移实验发现LNCaP与LNCaP/PrLZ细胞穿膜细胞数分别为64.8±8.7与69.3±7.6个细胞/视野,两者相比差异无统计学意义(P>0.05),而侵袭实验中LNCaP与LNCaP/PrLZ细胞穿膜细胞数分别为70.7±2.8与190.5±9.3个细胞/视野,两者相比差异有统计学意义(P<0.001),Westernblot证实LNCaP/PrLZ细胞中MMP-2表达水平显著上调,明胶酶谱分析证实LNCaP/PrLZ细胞MMP-2的活性增强.结论:PrLZ在前列腺癌的侵袭过程中可能起一定作用.
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PrLZ基因3'-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测
目的 分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3'非编码区(3' UTR)可能的微小RNA (miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具.方法 使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3'-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3'-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3'-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称NC)和过表达miR-34a(质粒名称miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293 T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3'-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性.结果 得到含PrLZ基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性.在miR 34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建PrLZ基因3'-UTR荧光素酶报告载体,miR 34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点.
