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结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达
目的 构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白.方法 将目的 基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2.结果 成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21(DE3)plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化.结论 成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103 、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达.
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结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测
目的：构建结核分支杆菌 phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到 pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加 IPTG 诱导表达,表达产物经 SDS-PAGE鉴定后用含 Ni2+的 His-bind树脂柱亲和层析纯化 phoS2,并用 Western blot 对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒 phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的 SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明 phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的 phoS2分子质量为37953 ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37953.1 ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1~19位,结构域位于1~370位。结论成功构建了结核分支杆菌 phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。
