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重组耻垢分枝杆菌Msmc2-CFP10-ESAT6的构建
目的 构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌.方法 采用基因拼接(Gene SOEing)法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性.结果 经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别.结论 结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达.
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结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体.方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体.利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%.结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断.
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早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6
目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值.方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6.结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%.结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法.
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微滴数字PCR定量检测全血样品中结核分枝杆菌特异CFP10基因
目的 采用微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)检测全血中结核分枝杆菌特异性CFP10(10-kDa culture filtrate protein,CFP10)基因的拷贝数含量.方法 收集10例活动性肺结核患者(active tuberculosis,aTB)、10例肺外结核患者(extrapulmonary tuberculosis,EPTB)和5例健康对照者(healthy donars,HDs)全血并提取DNA,优化引物佳扩增条件并制定重组质粒标准曲线,对样本中CFP10基因的拷贝数含量分别用ddPCR与实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)进行检测和比较.结果 对重组质粒的灵敏度检测显示ddPCR技术明显优于qPCR技术.对样本的检测显示qPCR技术检测aTB、EPTB患者与健康人的全血中CFP10含量之间无统计学意义;但是ddPCR技术检测aTB、EPTB患者与健康人之间有显著统计学意义(P＜0.0001);ddPCR检测aTB和EPTB患者(共20例)CFP10基因绝对定量的浓度约为3.4 ～ 94.0 copies/μL.结论 本研究首次报道采用ddPCR技术能灵敏地用于TB患者全血的诊断.
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化
目的 克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原.方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性.结果PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库(Genbank)报道的完全一致.三者在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合.Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白.ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性.结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原.
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结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用
以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).
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结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究
目的 研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果.方法 以构建的真核表达载体pEGFP-N1ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP N1组(P-N1)、pEGFP-N1 ESAT6组(P-N1-E)、pEGFP N1-CFP10组(P-N1-C)、卡介苗加pEGFP-N1组(K+P-N1)、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组(K+P-N1-E)和卡介苗加pEGFP-N1 CFP10组(K+P-N1-C).每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次.以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化.结果 免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体.但二者血清中IFNγ水平都有显著上升,K+P N1-C和K+P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为(107.591±7.3281)pg/mL和(95.7503±9.0184) pg/mL,显著高于免前、一免、二免(P＜0.01).结论 结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础.
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ESAT6和CFP10融合蛋白抑制巨噬细胞自噬体形成的实验研究
目的 观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用.方法 雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总RNA和蛋白,以RT-PCR和免疫印迹方法检测自噬相关基因(atg)表达水平的变化.结果 ESAT6-CFP10融合蛋白后可抑制巨噬细胞中自噬体的形成,显著提高CFU指数(P＜0.05),并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降为明显(P＜0.05).结论 ESAT6和CFP10融合蛋白可通过调控atg表达水平影响巨噬细胞自噬功能.
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结核分枝杆菌CFP10的基因克隆及表达
目的 克隆结核分枝杆菌CFP10基因,在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究其在结核病诊断中的价值奠定基础.方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对CFP10的基因进行扩增,以PET-30a(+)为载体构建重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5a中,抽提质粒,进行双酶切鉴定,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式.结果 构建了具有正确基因序列的CFP10重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达.结论 目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础.
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牛分枝杆菌特异性四联融合蛋白在牛结核病诊断中的临床应用
目的 以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA).方法 用iELISA检测90 份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17.iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本;以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国黑白花奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清;对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性.结果 iELISA与ICG的符合率为93.33%(140/150),与TST的总符合率为87.32%(489/560),与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22).以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%.结论 该方法具有较高的灵敏度与特异性,与其它方法有较高的符合率.
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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立
目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10 融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染.结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.
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重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达
目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性.方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析.将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性.结果:成功构建PQE30-cfp 10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别.结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10.
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分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究
目的 构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗.方法 采用基因拼接(Gene SOEing)法,体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因,插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,用电穿孔法将pBCG3000-CFP10-ESAT6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,SDS-PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达,Western blot鉴定其生物活性.结果 经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白.可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别.结论 分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功.
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结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达
目的 构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白.方法 将目的 基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2.结果 成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21(DE3)plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化.结论 成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103 、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达.
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结核分枝杆菌cfp10基因的克隆及序列分析
目的 扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因(cfp10),并将其克隆至质粒pGEX-4T-1中进行核苷酸序列分析.方法 应用聚合酶链式反应(PCR)技术从结核分枝杆菌基因组DNA中扩增得到cfp10基因,将其定向插入载体pGEX-4T-1并转化大肠杆菌JM109,对重组质粒(命名为pGcfp10)进行限制性酶切分析及PCR鉴定.用双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定,并与GenBank中报道的cfp10基因进行比较.结果 成功克隆了约303bp的cfp10基因片段,测序结果表明,所克隆的cfp10基因序列与GenBank公布的一致性为100%.结论 获得了序列正确的cfp10基因,为其原核表达及相关研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力
目的: 研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力.方法: 用预先转移到硝酸纤维素膜条的ESAT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠.用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数.结果: ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶ 6 400.淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19 ng/L和0.211±11 ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%.与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微.结论: ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
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结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达
目的: 构建结核分枝杆菌(MTB) lhp基因原核表达载体并进行表达.方法: 用PCR扩增MTB lhp基因, 并克隆入pQE30质粒.测序正确后, 再亚克隆入pET32a(+)质粒, 构建pQE30-CFP10和pET32a(+)-CFP10重组体.结果: 以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后, 经IPTG诱导, pQE30-CFP10未表达目的蛋白; 而pET32a(+)-CFP10则表达出Mr为 20 000左右重组蛋白.SDS-PAGE分析显示, IPTG诱导4 h重组蛋白的表达量高.表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的38%, 用Western blot证实其具有良好的抗原性.经Ni-NTA柱纯化, 获得纯度为93%的重组蛋白.结论: 成功地构建原核表达载体pET32a(+)-CFP10, 并获得重组CFP10蛋白, 为MTB重组抗原的应用奠定了基础.
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Th1型细胞因子基因对结核分枝杆菌基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗CFP10抗体水平的影响
目的: 研究分别表达含IL-12和IL-18基因的质粒, 对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)H37Rv株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响.方法: 从正常人外周血单个核细胞(PMBCs)中提取RNA, 用RT-PCR扩增IL-18 cDNA, 并克隆入载体pGEM-Teasy中.测序证实后, 亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1的BamH I和EcoR I酶切位点.将分别表达小鼠IL-12和人IL-18基因的真核表达质粒pcmIL12和pcIL18,与MTB CFP10基因疫苗联合肌注免疫BALB/c小鼠, 共免疫3次, 每次间隔2 wk.每次免疫后2 wk采血、分离血清, 用ELISA检测小鼠血清抗CFP10抗体的滴度. 结果: 用RT-PCR成功地从人PMBC的RNA中扩增出IL-18 cDNA, 测序结果正确.用BamH I和EcoR I酶切鉴定证实, 目的基因已插入载体pcDNA3.1中, 阳性克隆命名为pcIL18.pcCFP10组第1次免疫后, 血清抗CFP10抗体的平均滴度为1∶600, 末次免疫后的滴度为1∶4 000.pcIL18+pcCFP10组联合免疫后, 血清抗CFP10抗体的滴度高于pcCFP10组, 终达1∶8 000.而pcmIL12+pcCFP10组联合免疫后滴度仅为1∶200.结论: pcIL18与CFP10基因疫苗联合免疫, 可增强CFP10抗原的特异性体液免疫应答; pcmIL12则可使CFP10基因疫苗产生的抗体水平降低.pcIL18+pcCFP10基因联合免疫是否具有增强CFP10抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究.
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表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性
目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100 μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次. 末次免疫结束2 wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105 MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4 wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 800. 淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P＜0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用.
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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达
目的:构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达. 方法:用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后克隆入含esat6基因的pGEM-7zf(+)载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为350 bp. 重组真核表达质粒酶切后可获得约630 bp的融合esat6-cfp10基因片段. RT-PCR可获得大小约为350 bp的cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染. 结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达.
