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结核分枝杆菌Rv3245蛋白抗原免疫学特性的研究
目的：：研究结核分枝杆菌Rv3425蛋白免疫学特性,评估其诊断应用价值及在结核致病性中的作用。方法：将Rv3425基因克隆至pET28a载体中,诱导表达Rv3425融合蛋白并进行纯化；利用ELISA、Western blot分析其抗原性与特异性；流式检测该抗原对巨噬细胞凋亡的影响。结果：获得了可溶性原核表达融合蛋白Rv3425,Rv3425蛋白能刺激灭活结核分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生高水平的特异性IFN-γ、纯化的Rv3425蛋白能与结核感染小鼠血清特异性结合,其特异性血清抗体IgG及IgM在结核病人中的水平明显高于健康人,发现该蛋白能诱导巨噬细胞的凋亡。结论：本研究发现结核分枝杆菌Rv3425蛋白具有较强的抗原性且能促进巨噬细胞的凋亡,这些发现对于结核病的诊断及致病机制的研究具有重要价值。
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结核分枝杆菌 Rv3425与 Rv3614c的相互作用
为探究结核分枝杆菌脯氨酸‐脯氨酸‐谷氨酸（PPE ）蛋白家族 Rv3425的生物学功能，利用免疫共沉淀联合质谱分析，在卡介苗（BCG）中筛选与Rv3425相互作用的蛋白。首先，以聚合酶链反应（PCR）扩增获得Rv3425基因，并克隆于pMV261载体。将重组载体转化入BCG ，裂解细胞，蛋白免疫印迹法证实目的蛋白可在BCG中表达。通过免疫共沉淀，用特异抗体分离出BCG中的Rv3425蛋白复合体，质谱鉴定其成分，在美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中检索各蛋白的功能，筛选与 Rv3425相互作用的蛋白，并用谷胱甘肽 S‐转移酶（GST ） pulldown验证。结果显示，免疫共沉淀联合质谱分析筛选到10个与Rv3425相互作用的蛋白，在细胞内Rv3425协同作用下参与肽聚糖合成途径、分枝菌酸合成途径、ESX‐1蛋白分泌系统及细菌毒力调控。GST pulldown验证发现Rv3614c与Rv3425可体外结合。本研究证实 Rv3425与 Rv3614c存在相互作用，Rv3425可能与ESX‐1蛋白分泌系统及结核分枝杆菌致病机制密切相关。
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针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究
选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425，构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39），并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因，构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）；PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段，插入pVAX1载体，构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）；PCR扩增Rv2029c基因，插入A3，构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞，蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠，共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组，采用电脉冲导入免疫，每2周免疫1次，共3次，用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示，A39免疫小鼠后，能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞，外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加，CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明，构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应，显示出良好的抗结核潜力，可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化
目的 克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原.方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性.结果PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库(Genbank)报道的完全一致.三者在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合.Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白.ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性.结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原.
